猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。

香菇多糖对蛋鸡生长性能、免疫功能及禽流感疫苗免疫效果的影响

为掌握香菇多糖对蛋鸡生长性能、免疫功能及禽流感疫苗免疫效果的影响,试验将120只1日龄禽流感非免疫罗曼灰蛋鸡随机分为4组,对照组不添加香菇多糖,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别添加50、100、200 mg/kg香菇多糖进行试验,试验为期77 d。结果显示,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ平均日增重显著高于对照组(P<0.05),料重比显著低于对照组(P<0.05),Ⅲ组最佳;Ⅲ组蛋鸡血清中IL-2和IFN-γ水平显著高于对照组(P<0.05);禽流感疫苗免疫后,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组蛋鸡禽流感H5抗体水平均显著高于对照组(P<0.05),Ⅲ组抗体水平最高。结果表明,香菇多糖可以提高蛋鸡生长性能、免疫功能及禽流感疫苗免疫效果,在本试验条件下,香菇多糖的最佳添加量为200 mg/kg。

2011年-2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S（GenBank登录号：JN547228）、疫苗株CV777（GenBank登录号：AF353511）和Attenuated DR13（GenBank登录号：JQ023162）的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。

10株广西猪圆环病毒3型(PCV3)全基因组序列的遗传变异分析

为了解广西猪群猪圆环病毒3型(PCV3)的遗传变异情况,以PCV3阳性DNA为模板,利用PCR的方法分2段扩增PCV3全基因序列并进行拼接,获得10株PCV3全基因组序列,全长均为2000 bp。10株广西PCV3全基因组序列之间的核苷酸同源性为98.6%~99.8%。与国内其他毒株的同源性为97.9%~99.8%;与国外其他毒株的同源性为98.8%~99.7%。10株广西PCV3 Cap基因的大小均为645 bp,编码214 aa。PCV3 Cap基因比较保守,10株广西PCV3 Cap基因与参考株相比,仅存在散在的突变位点。基于PCV3全基因和Cap基因构建的遗传进化树显示,两者结果基本相同,10株广西PCV3处于3a和3b两个亚群。本试验表明,广西地区猪群中流行的PCV3至少存在2个亚群,不同亚群PCV3毒株的致病性差异还有待进一步的研究。

8株鸽源新城疫病毒广西分离株HN基因的遗传进化分析

应用RT-PCR方法对分离自广西不同鸽场的8株鸽源NDV广西分离株HN基因进行扩增、序列测定和分析,旨在探讨广西鸽源NDV HN基因的分子进化特点,为科学防控鸽源新城疫提供依据。结果显示,8株鸽源NDV广西分离株HN基因的ORF全长均为1 716 bp,编码571个氨基酸,属于强毒的C群,符合强毒株的基因长度特征。核苷酸同源性比较显示,8株鸽源NDV分离株与NDV基因Ⅵ型中的Ⅵb亚型同源性最高,为90.4%~99.5%。遗传进化分析显示,8株鸽源NDV广西分离毒株与我国2011-2013年广西、广东、吉林、辽宁、云南、黑龙江等地鸽源NDV分离株的遗传关系较为接近,位于同一进化树分支上,初步推测8株鸽源NDV广西分离株应属于classⅡ基因Ⅵb亚型NDV。

猪流行性腹泻病毒变异株CH/GX/750A/2015在Vero细胞上转瓶培养条件的优化试验

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒(PEDV)变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件,为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒,对接毒时细胞维持液中胰酶浓度(0、2、4、6、8和10μg/mL)、细胞密度(40%、60%、80%、100%、200%)、接毒剂量(MOI分别为1、0.1、0.01和0.001)、吸附时间(0、30、60、90、120、240 min)、收毒时间(接毒后12、24、36、48、60、72 h)、维持培养温度(35、36、37和38℃)和转瓶转速(6、8、10、12、14、16 r/h)7个条件进行优化。结果显示,PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为:细胞刚铺满单层时接毒,接毒量为MOI=0.01,维持液(无血清DMEM培养液)中胰酶质量浓度为6μg/mL,不需吸附,维持培养温度为37℃,12 r/h旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液,效价可稳定达到106.50 TCID50/0.1 mL。本试验为PEDV变异株大量培养提供了参考,为变异株疫苗研发奠定了基础。

猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法的建立与初步应用

[目的]建立1种快速、灵敏、特异的检测猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法。[方法]根据JEV E基因序列的保守区6个位点设计了4条特异性LAMP引物,以JEV阳性样品RNA为模板进行一步法扩增,并对反应条件和反应体系进行了优化。[结果]该方法具有较高的灵敏度,其检测极限为0.5 pg;特异性试验表明其具有较高的特异性,对其他病毒性病原体均无扩增反应。与RT-Nested-PCR相比,2种方法检出率的符合率为90.9%。反应结束后可以通过添加化学发光剂进行可视化观察,大大缩短了检测时间。该方法无需特殊仪器,只需在水浴锅中进行,是一种适于基层的简便、灵敏、快速的猪JE的检测方法。[结论]成功建立了猪流行性乙型脑炎RT-LAMP方法,并在临床上进行了初步应用。

一株鸡源发酵乳杆菌益生菌的分离鉴定

筛选优质鸡源益生菌菌种,为畜禽微生态制剂的研发提供优质的菌株来源,为开发禽用微生态制剂提供安全高效菌种资源和理论支撑。试验以健康鸡肠道为分离材料,使用MRS培养基(乳酸菌细菌培养基)进行分离培养,并对分离菌株进行形态特征、生理生化鉴定及分子生物学鉴定。试验研究发现在鸡盲肠中分离获得一株细菌,鉴定为发酵乳杆菌,编号为J4。分离获得的菌株具有耐热、耐酸、耐胆盐等特点,同时对动物机体安全无毒,可作为鸡源发酵乳杆菌益生菌的优良候选株。

近年广西部分猪场蚊子携带猪乙型脑炎病毒初步检测调查

为进一步了解近年广西猪场蚊媒携带乙型脑炎病毒(JEV)情况,采用套式RT-PCR(RT-nPCR)检测方法,于2016年—2019年间对猪乙型脑炎(JE)确诊阳性病例的部分猪场进行蚊子携带JEV情况初步检测调查。对抽选16个有JE阳性病例的猪场捕捉的蚊子进行JEV检测,结果均为阳性。表明广西猪JE确诊阳性病例猪场的蚊子携带JEV的几率很高。

猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792 E基因主要抗原域的原核表达及抗原性鉴定

对广西猪JEV FC792株的E基因主要抗原域Ⅰ、Ⅱ基因(Ea基因)进行原核表达及抗原性鉴定,为猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)诊断抗原和基因工程疫苗的研制奠定基础。结果:成功构建广西猪JEV FC792株Ea基因的克隆重组质粒pMD18-T-Ea及表达重组质粒pET32a-Ea,经SDS-PAGE及Western blot鉴定表明,JEV FC792株Ea蛋白在Rosetta(DE3)菌中成功进行融合表达,表达出约58 KDa的融合蛋白;经抗原性鉴定表明,表达的融合蛋白Ea能与猪JEV阳性血清抗体发生特异性反应,融合蛋白Ea具有良好的JEV抗原性。

西番莲茎叶提取物对热应激下蛋鸡产蛋性能、蛋品质和抗氧化性能的影响研究

试验旨在了解西番莲茎叶提取物对夏季热应激下蛋鸡产蛋性能、蛋品质和抗氧化性能的影响。试验于夏季选取210日龄海兰褐蛋鸡240只,随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4组,对照组饲喂基础日粮,低、中、高剂量组分别在基础日粮中添加250、500、1000 mg/kg的西番莲茎叶提取物,试验期42 d。结果显示,低、中、高剂量组蛋重均显著高于对照组(P<0.05),高剂量组产蛋率显著高于对照组(P<0.05),高、中剂量组平均日采食量显著高于对照组(P<0.05),高剂量组料蛋比显著低于对照组(P<0.05)。高、中剂量组鸡蛋的蛋白高度和哈夫单位显著高于对照组(P<0.05),高剂量组鸡蛋的蛋壳厚度显著高于对照组(P<0.05);各组蛋黄重、蛋黄比例、蛋形指数和蛋黄颜色无显著差异(P>0.05)。高、中剂量组血清中谷胱甘肽过氧化物酶活性显著高于对照组(P<0.05);低、中、高剂量组血清中丙二醛(MDA)含量显著低于对照组(P<0.05);各组间血清中超氧化物歧化酶、总抗氧化能力和过氧化氢酶活性差异不显著(P>0.05)。说明西番莲茎叶提取物可提高夏季热应激条件下海兰褐蛋鸡产蛋性能、蛋品质和抗氧化性能。

屠宰猪肠道沙门氏菌的分离鉴定、耐药性分析及致病性试验

为了解广西南宁市猪源沙门氏菌的污染状况、耐药状况及致病力情况,在南宁市某生猪屠宰场随机直接从131头屠宰猪的肠道采集样品,采用鉴别培养基分离,生化鉴定的方法对样品中的沙门氏菌进行分离鉴定,并采用标准K-B纸片法对分离菌株进行25种抗生素敏感试验,最后对分离株进行小白鼠致病性试验。结果从131份屠宰猪的肠道中共分离到沙门氏菌45株,检出率为34.35%;其中鼠伤寒沙门氏菌14株,甲型副伤寒杆菌2株,肠炎沙门氏菌3株。45株分离菌株全部耐药,耐药率高达100%,其中44株为多重耐药菌株,占97.78%。45株沙门氏菌中有40株对小白鼠具有致病性,致病率达88.89%。这表明南宁市的屠宰猪存在一定程度的沙门氏菌污染,并且分离菌株存在较严重的耐药现象以及具有较强的致病性。应采取有效措施控制沙门氏菌在猪群中的污染和限制抗生素在养猪过程中的使用并严格遵守休药期,以减少细菌耐药性的产生,保障猪肉及猪肉制品的食品安全。

猪支原体肺炎研究进展

猪支原体肺炎是猪肺炎支原体所引发的一种以气喘为主要症状,以肺部对称性肉变为主要病理变化的慢性接触性呼吸道传染病,在世界各地普遍存在,严重危害养猪业的健康发展。随着对猪肺炎支原体的深入研究,发现其单一感染致死率虽低,但是易引发其他病毒或细菌等病原的续发或并发感染,导致猪呼吸道疾病综合征,使得疫情变得更为复杂,增加猪病诊断与防控的难度,造成巨大的经济损失。论文根据猪肺炎支原体的最新研究进展,从病原学、流行病学特点、主要抗原蛋白的研究、诊断、疫苗研制、防控措施等六个方面做一综述,从而为猪肺炎支原体的进一步研究及该病的防控提供新思路。

广西猪乙型脑炎血清流行病学调查分析

【目的】了解广西地区猪乙型脑炎(JE)的感染情况及流行态势,为制定广西猪群JE监测和防控体系提供参考依据。【方法】2008～2010年,采集广西边境14市未经JE疫苗免疫的2597份猪血清,采用LAT检测乙型脑炎病毒(JEV)血清抗体,并对不同区域、季节和年龄段等猪群JE流行状况进行分析。【结果】广西受检猪群JEV血清抗体平均阳性率为60.65%;感染率以桂南地区最高(72.15%),桂北地区最低(35.71%);夏秋季节(5～11月)是主要流行季节,平均JEV血清抗体阳性率达70.67%,3～4月仅为26.75%;2008～2010年,猪群JEV血清抗体阳性率总体呈上升趋势。【结论】广西受检猪群JE感染较普遍,有一定的地域性及季节性,且感染率呈逐年上升趋势。猪是JEV重要的贮存宿主及传染源,应采取有效的监测与防控措施,杜绝猪JE的流行传播。

2016-2019年广西部分猪场仔猪病毒性腹泻的流行病学调查

本研究旨在了解引起仔猪腹泻的主要病毒性病原感染情况及流行特点,为有效防控广西仔猪腹泻提供科学依据。试验采用RT-PCR/PCR检测方法对2016年3月至2019年2月广西14个地级市366个规模猪场送检的914份仔猪腹泻病料样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪Delta冠状病毒(PDCoV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)检测,并分析其阳性率在不同年份、季节、地区之间的差异及病原混合感染情况。调查结果显示,PEDV、PDCoV、PRRSV、PoRV、PCV2、CSFV、PRV均存在不同程度的感染,其样品平均阳性率分别为59.74%、8.32%、7.77%、4.92%、3.72%、3.28%和2.08%,未检测出TGEV;PEDV已无明显季节性,一年四季均高发,即使在炎热的夏季,在感染猪群中也持续存在,PDCoV有明显的季节性,多发生在冬春寒冷季节;广西仔猪腹泻PEDV阳性率高,单一感染高达50.55%,仔猪腹泻混合感染情况也较多,其中以二重感染情况较为常见,同时也存在四重感染现象。结果表明,广西腹泻仔猪存在7种病毒性病原不同程度感染情况,其中以PEDV导致的仔猪病毒性腹泻尤为严重,新发PDCoV阳性率仅次于PEDV,需重视并加强对新发PDCoV的防控。

广西猪圆环病毒3型流行病学调查与分析

本研究旨在了解新发猪圆环病毒3型(porcine circovirus 3,PCV3)在广西猪群的感染情况及流行特点,为有效防控PCV3提供科学依据。试验采用PCR检测方法对2017年9月至2019年3月广西482个规模猪场送检的917份病猪样品进行PCV3检测,并分析PCV3阳性率在广西不同地区、年份、季节和年龄段猪群之间的差异。对145份PCV3阳性病料进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测。结果显示,PCV3除在百色、防城港未检出,在广西其他12个地市均存在不同程度的感染;2017~2019年广西PCV3样品阳性率和PCV3猪场阳性率均呈逐渐上升趋势;夏季PCV3阳性率最低,且明显低于其他3个季节;育肥猪PCV3阳性率最高,为21.70%,其次是流产母猪、保育猪、流产胎儿,阳性率分别为20.00%、19.05%和11.02%,哺乳仔猪PCV3阳性率最低,为8.21%;PCV3单一感染率较高,为30.34%,与其他病原混合感染情况也较为常见,甚至出现四重感染。调查结果表明,PCV3感染在广西普遍存在,且近年来感染呈增加趋势,可能有一定的季节性,对各生长阶段猪群均有一定程度的危害,以育肥猪最为严重,对母猪和保育猪危害也较大;PCV3单一阳性率较高,但仍以混合感染为主,尤其是与PRRSV和PCV2的混合阳性率较高,提示这3种病原在感染致病过程中可能存在协同作用。

猪支原体肺炎灭活疫苗的临床应用对比研究

为了评估5种市售的猪支原体肺炎(MPS)灭活疫苗的临床免疫效果,试验将规模猪场300头3日龄体重接近的仔猪随机分为5个免疫接种疫苗组[以猪肺炎支原体(Mhp)J株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗A组,以P-5722-3株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗B组,以P-5722-3株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗C组,以SY株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗D组,以NJ株为疫苗株的猪支原体肺炎灭活苗E组]和1个对照组,所有猪只于3,30,90,120,150日龄采血,175日龄解剖观察测定肺脏病变情况并进行Mhp抗原检测;测定猪群的体重、平均日增重、Mhp血清抗体水平、肺脏病变评分和肺组织Mhp阳性率,评价5种MPS灭活疫苗的临床免疫效果。结果表明:各疫苗组出栏重和平均日增重均较对照组有提高,其中3~27日龄仔猪阶段,D组平均日增重显著高于对照组(P<0.05);疫苗组较对照组肺脏病变程度减轻,降低幅度为8.3%~38.8%,其中D组降低幅度最大。各疫苗组之间Mhp阳性感染率差异不显著(P>0.05),A、C、D组猪只Mhp阳性感染率低于对照组,D组最低(为68.0%);3日龄开始,各组试验猪Mhp抗体水平呈下降趋势,至120日龄时降至最低。150日龄时,除D组Mhp抗体阳性率为0外,其他各组均出现Mhp抗体转阳的情况。说明5种疫苗对防止猪群感染Mhp或减轻症状具有不同程度的效果,其中D组MPS灭活苗(SY株)免疫效果更好,能显著提高仔猪的生长性能,减轻肺脏损伤。

2014-2018年广西6种猪主要病毒性繁殖障碍疫病流行病学调查

试验旨在了解广西猪主要病毒性繁殖障碍疫病的发生态势,为预防和控制此类疫病提供科学依据。采用RT-PCR/PCR方法对2014年3月至2018年2月采自广西的349份流产胎儿样品进行猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及猪乙型脑炎病毒(JEV)6种主要病毒性繁殖障碍疫病病原的检测并分析其阳性检出率在不同年份、季节之间的差异及病原混合感染情况。结果显示,2014-2017年,6种病原的猪场阳性率从高到低依次为JEV(36.00%)、PRRSV(16.00%)、PCV2(9.00%)、PRV(7.00%)、PPV(6.00%)和CFSV(5.00%),样品阳性检出率从高到低依次为JEV(27.06%)、PRRSV(6.18%)、PRV(5.88%)、PCV2(3.82%)、CSFV(2.35%)和PPV(2.35%)。季节因素对6种病毒性繁殖障碍疫病的发生有一定影响:JEV在夏季、秋季检出率较高,春季、冬季检出率较低;PRRSV一年四季检出率均较高,且无明显差异;PCV2在春季检出率较高,其次是夏季和冬季,秋季检出率较低;PRV在春季、冬季检出率较高,夏季、秋季检出率均为0;PPV在夏季检出率较高,其次是春季和秋季,冬季检出率为0;CSFV在冬季检出率最高,其次是夏季,春季和秋季检出率均为0。流产胎儿以单一感染为主,6种病毒均存在不同程度单一感染情况,单一感染率JEV最高(23.82%)、PCV2最低(0.59%);混合感染以双重感染为主,其中以2016年双重感染情况较多,且感染组合多样;三重感染情况较少、仅在2016年送检样品中发现1例,未发现四重及四重以上感染情况。调查结果表明,2014-2017年,JEV均有较高的阳性检出率,已成为广西部分猪场母猪流产最主要病毒性病原。PRRSV和PRV仍是目前引起广西猪场母猪流产的主要病毒性病原。

2017—2021年广西腹泻猪群主要病毒性腹泻病原检测

为掌握广西地区导致猪群腹泻的主要病毒性病原的流行态势,为养殖场猪病毒性腹泻的综合防控提供依据,用实时荧光RT-PCR检测方法,对2017年1月—2021年6月广西14个地市489个猪场1206份临床腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)等病原检测,并分析其阳性检出率在不同年份、季节、地区、年龄段猪群之间的差异以及病原混合感染情况。结果显示,2017—2021年,PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV样品阳性检出率分别为49.67%、7.63%、4.56%和0.33%,场阳性检出率分别为53.37%、8.18%、8.18%和0.61%;病毒性腹泻病原有一定的季节性流行特征,多表现为冬、春季流行加重;PEDV、PDCoV普遍流行,PoRV局部流行,TGEV散发流行;4种病原对不同年龄段腹泻猪群的感染率存在差异,其中对哺乳仔猪危害最为严重;猪群以单一感染为主,主要为PEDV单一感染,阳性检出率为47.93%,混合感染均为二重感染且感染率较低。结果表明,导致广西地区猪群腹泻的主要病毒性病原主要为PEDV、PDCoV和PoRV,其中PEDV为最主要病原,其他病原也呈流行加重趋势,需进一步加强病原监测和疫病综合防控。

猪丁型冠状病毒CH/GX/1468B/2017的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究于广西某猪场采集疑似感染猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)的腹泻仔猪小肠及其内容物进行病毒分离,并通过细胞病变(CPE)、RT-PCR、间接免疫荧光(IFA)和全基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定。结果显示,试验成功分离到1株PDCoV,命名为CH/GX/1468B/2017(简称PDCoV 1468B)。该毒株可稳定有效地在LLC-PK细胞生长增殖,并引起典型CPE;该毒株已在LLC-PK细胞连续传代15代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在108.10TCID50/mL以上。该毒株全基因组序列长25 399 nt;与23个GenBank中登录的参考毒株的全基因组序列比对显示,核苷酸同源性为97.2%~99.4%,其中PDCoV 1468B分离毒株与Vietnam/Binh21/2015株同源性最高,为99.4%。全基因组系统进化分析显示,PDCoV 1468B分离毒株属于Ⅱ群,与东南亚国家PDCoV毒株亲缘关系密切,处于同一进化分支。综上所述,本研究成功分离出PDCoV 1468B株并进行了全基因序列分析,为进一步开展PDCoV致病性等生物学特性研究及疫苗研制奠定了基础,同时可为PDCoV的遗传进化提供数据支持。