代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌促进L-异亮氨酸发酵合成的研究进展

L-异亮氨酸作为必需氨基酸具有多种生理功能,对人体和动物健康有重要的调节作用。微生物发酵是工业生产L-异亮氨酸的主要方式,而谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)是L-异亮氨酸发酵生产的主要菌株,主要通过筛选和随机诱变得到,其遗传背景不明且很难通过诱变进一步提高产量,因而通过代谢工程改造谷氨酸棒状杆菌生产L-异亮氨酸成为近年来研究热点。该文综述了近年来代谢工程改造谷氨酸棒杆菌促进L-异亮氨酸生物合成的相关研究,主要涉及代谢通量调控、解除反馈抑制、强化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)水平以及提高产物分泌能力等方面,对进一步改造菌株和促进L-异亮氨酸发酵合成具有一定的参考意义。

槲皮素抑制黄嘌呤氧化酶活性促进环磷酸腺苷发酵合成

利用补救途径发酵生产环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)时,黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)受次黄嘌呤诱导大量生成,将部分次黄嘌呤分解为尿酸,并伴随活性氧的产生,导致次黄嘌呤转化率低下和cAMP产量难以提高等问题。摇瓶发酵实验表明,添加槲皮素和木犀草素可以提高cAMP产量。在7 L发酵罐上,通过添加12 mg/L槲皮素,cAMP发酵产量达到5.33 g/L,与对照相比提高了33.92%,同时次黄嘌呤转化率得到明显提升,发酵性能显著提高。关键酶活性分析结果表明,槲皮素有效抑制XOD活性,减少了次黄嘌呤的分解,进而提高其转化率;6-磷酸葡萄糖脱氢酶、腺苷琥珀酸合成酶与腺苷酸环化酶活性均得到显著提高,更多碳流分配到磷酸戊糖途径用于产物合成。副产物尿酸含量的显著减少也表明次黄嘌呤的分解得到有效抑制。活性氧、丙二醛以及抗氧化酶活性的测定结果表明,槲皮素抑制XOD的活性,显著降低了活性氧含量,缓解氧化胁迫对细胞组分造成的损伤,增强细胞活性,使cAMP产量得到显著提升。

辅助能量物质与谷胱甘肽协同作用促进环磷酸腺苷发酵生产

目的:探究添加辅助能量物质导致环磷酸腺苷(cAMP)发酵后期产物合成停滞的原因,针对性解除限制因素,进一步提高产物产量。方法:在7 L发酵罐上进行添加辅助能量物质的发酵实验,对发酵动力学参数、细胞活性、能量代谢水平以及活性氧(ROS)含量等进行分析,根据分析结果进行了耦合添加谷胱甘肽和辅助能量物质的发酵实验。结果:单独添加柠檬酸钠、丙酮酸钠批次的产物合成和菌体生长速率在发酵前期均明显高于对照,约30 h后快速下降,降至低于对照批次的低水平;菌体活性、ATP/AMP以及电子呼吸链活性在发酵36 h后也剧烈下降,下降幅度远远大于对照批次。添加辅助能量物质导致ROS和丙二醛在发酵36 h后迅速积累,极显著(P<0.01)高于对照批次,而NADPH/NADP^(+)却快速下降,明显低于对照。耦合添加辅助能量物质和谷胱甘肽的发酵批次中,细胞活性得到较大提升,cAMP产量得到进一步提高。柠檬酸钠耦合GSH批次与丙酮酸钠耦合GSH批次的cAMP产量分别达到4.05和4.32 g/L,比单独添加GSH批次分别提高了15.2%和22.7%,与对照(无辅助能量物质和谷胱甘肽添加)相比分别提高了21.9%和30.1%。结论:辅助能量物质强化能量代谢促进产物合成的同时,增加了电子呼吸链中电子泄漏的几率,大量活性氧产生超出细胞承受能力,导致发酵后期细胞生长和产物合成的停滞。辅助能量物质与谷胱甘肽协同作用,有效缓解了氧化胁迫,提高细胞活性,进一步促进产物发酵生产。

低聚磷酸盐促进cAMP发酵合成的全局转录组分析

目的:以节杆菌Arthrobacter sp. CCTCC 2013431为研究对象,探究低聚磷酸盐作为能量供体促进环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)发酵合成的作用机理。方法:在7 L发酵罐中添加低聚磷酸盐,对发酵性能、转录组学、关键酶活性以及重要代谢物水平进行分析,揭示低聚磷酸盐促进cAMP发酵合成的机理。结果:发酵24 h添加2 g/L六偏磷酸钠,cAMP产量显著提高,达到3.64 g/L,与对照组相比提高了33.82%。转录组数据分析表明,由于六偏磷酸钠的添加,227个基因表达量显著上调,265个基因表达量显著下调;磷酸戊糖途径和cAMP合成途径中多数酶编码基因的转录水平,电子传递链中复合体Ⅲ、复合体IV和F0F1-ATP酶以及聚磷酸盐激酶编码基因的转录水平,硫氧还蛋白、过氧化氢酶及CLP蛋白酶等编码基因的转录水平均显著提高。此外,对丙酮酸激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、腺苷琥珀酸合成酶、腺苷酸环化酶、过氧化氢酶、聚磷酸盐激酶活性以及胞内活性氧、ATP和NADPH等进行测定,进一步证明了转录组分析结果。结论:六偏磷酸钠能够强化磷酸戊糖途径与cAMP合成途径,提高ATP供应,同时维持胞内氧化还原平衡,促进产物合成与积累。