口蹄疫病毒实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

基于口蹄疫病毒聚合酶3D蛋白基因的序列分析,设计合成了特异的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.试验表明,实时TaqMan荧光定量RT-PCR能特异性检测A、O、Asia I 3种血清型的口蹄疫病毒,对猪水泡病、猪瘟、蓝耳病等猪常见病原检测结果均为阴性.对比检测试验表明,实时Taq-Man荧光定量RT-PCR的检测敏感性比常规的多重RT-PCR提高达105倍,对口蹄疫病毒细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达0.063个TCID50.对临床样品的检测试验证实,该方法可以有效检测临床样品中的猪水泡皮、组织、血清及O-P液中的口蹄疫病毒.

纳米孔三代测序技术在禽流感病毒全基因组测序中的应用

纳米孔(Nanopore)测序技术是一项新兴三代测序技术,具有巨大应用前景,然而在动物病原领域中的应用还处于起步阶段。为探究该技术在禽流感病毒(AIV)全基因组测序中的应用,本研究对采自农贸市场的2份AIV阳性鸡咽喉拭子样品(分别命名为AIV1和AIV2)进行RNA提取,利用AIV通用引物靶向扩增其全基因组,扩增产物经末端修复、3'末端加A碱基、条形码连接和添加测序接头等步骤,完成测序文库制备。经GridION×5Mk1测序仪测序获得7.16G数据,所获得的测序数据经数据质控、过滤去除低质量reads、比对拼接得到AIV全基因组序列,整个试验流程在13 h内完成。同时,采用一代测序方法验证Nanopore测序结果的准确性。测序数据质控结果显示所有读长(reads)的质量分数均大于10,AIV1产生404474条reads,平均reads为996.7 bp,平均reads质量分数为13.8,AIV2产生76589条reads,平均reads质量分数为13.5,平均reads为1095 bp,表明测序数据质量较高;利用Samtools软件统计AIV 8个基因节段的覆盖率和各基因节段位点的测序深度,结果显示AIV1全基因组的覆盖率达100%,平均测序深度为34473×,AIV2全基因组的覆盖率达100%,平均测序深度为7470×,表明拼接结果可靠性高;所得测序结果与一代测序结果通过Geneious Prime软件对比,结果显示,二者的一致性达98.78%~100%,其中AIV1有7个基因节段测序结果的一致性为100%,AIV2有5个基因节段测序结果的一致性为100%,一致性最低的MP基因的一致性也达98.78%,表明本研究的测序方法准确性良好。本研究成功实现Nanopore三代测序技术在AIV全基因组测序中的应用,通过优化扩增条件和数据处理为AIV全基因组的测序提供了一种新方法,在新发突发禽流感疫情应急检测中将发挥重要作用。

动物疫病生态型监测预警策略分析

近年来,我国非洲猪瘟、欧美国家H5亚型高致病性禽流感等新发动物疫病的频发,给动物疫病监测工作提出了提高建设快速感知、识别新发突发传染病等风险因素能力的新要求。该文基于对当前动物疫病传播链的生态学分析和动物疫病监测工作的思考,提出了动物疫病监测工作的方法;通过基于风险的采样和生态型监测,提出了获得足够长时间稳定的动物疫病流行数据为基础的监测预警模式。这为有关部门开展监测预警工作提供了新思路,也为实现动物疫病的早发现、早预警、早应对和提升动物疫病监测的敏感性提供了一个新方法。

基于Nanopore测序技术的非洲猪瘟病毒全基因组测序方法建立

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种高度传染性和致死性疫病,近年来给我国生猪产业的健康发展造成了沉重打击。ASFV庞大的基因组导致人们难以及时掌握流行毒株的全基因组序列。本研究旨在利用Nanopore三代测序技术建立一种简便可靠的ASFV全基因组测序方法。设计覆盖ASFV全基因组的31对引物并分为4个引物池对样本进行扩增,通过Nanopore测序技术对扩增产物进行测序,进一步优化相关生物信息学分析方法,最终成功建立了ASFV全基因组测序方法。应用该方法成功从某环境拭子样本中获取一株全长为189 416 bp的ASFV全基因组测序。经一代测序验证表明,在B646L、EP402R、E183L、MGF_360-12L、MGF_505-3R和I177L等关键基因及部分变异位点上,本方法结果与一代测序结果一致性100%;在全基因组水平上,本方法结果与二代测序结果一致性为99.94%。此外,在这项研究中,采用Nanopore测序技术发现了NP1450L基因与NP419L基因间区存在56 bp的重复序列插入(通过一代测序技术进行了验证),但是二代测序未能发现这一显著的变异特征。本研究成功建立了基于Nanopore技术的ASFV全基因组测序方法,该方法具有良好的简便性和可靠性,为当前ASF的防控和分子流行病学研究提供了一个重要手段。

基于Nanopore测序技术分析广东地区1株PRRSV-2的基因组特征

为促进Nanopore测序技术在美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-2)全基因组测序中的应用并进一步了解当前广东地区PRRSV-2全基因组特征,本试验从广东地区某屠宰场采集1份PRRSV-2阳性样本,提取核酸进行靶向扩增,对扩增产物进行文库构建和测序,使用Samtools和Medaka等软件对测序数据进行生物信息学分析和拼接,得到样本的全基因组序列。选取5′端1~4 500核苷酸位点和开放阅读框5(ORF5)基因进行一代测序验证,评估本试验的准确性。进一步使用MEGA 11软件对所得的序列进行全基因组遗传进化分析、核苷酸相似性分析和NSP2蛋白氨基酸变异分析;使用RDP4软件和SimPlot软件进行重组分析。结果显示,本试验完成1份PRRSV-2阳性样本的全基因组测序,序列命名为GDYJ0718-7。2Samtools软件分析结果显示,本试验的平均测序深度为1 838×,覆盖PRRSV-2所有编码区。本试验Nanopore测序结果与一代测序结果一致性为100%。全基因组遗传进化分析结果显示,GDYJ0718-7属于QYYZ-like毒株,与参考株QYYZ(JQ308798)的核苷酸相似性仅为86.3%。NSP2蛋白氨基酸变异分析结果显示,GDYJ0718-7呈现1 aa+36 aa+29 aa的独特缺失模式。重组分析发现,GDYJ0718-7可能由QYYZ-like毒株和JXA1-like毒株重组形成。本试验通过Nanopore测序技术发现了广东地区QYYZ-like毒株变异的复杂性和新特点,为PRRSV-2的防控提供了技术和分子信息支持。

J亚群禽白血病病毒SCAU-0901株的分离鉴定

在组织病理学观察的基础上,经接种DF-1细胞系、ELISA抗原检测、聚合酶链式反应(PCR)以及亚群特异性免疫荧光试验(IFA),从送检的疑似禽白血病感染的麻黄肉种鸡中分离并鉴定出1株J亚群禽白血病病毒(ALV-J),命名为SCAU-0901。利用特异性引物分别扩增出长度为545 bp和2.2×103bp的目的片段,并对目的片段进行了克隆测序。序列分析发现,SCAU-0901株的gp85基因与国内外各ALV-J毒株相应核苷酸序列的相似性为86.1%～95.1%,其中与BJ0303株的相似性最高(95.1%),与ADOL-7501株的相似性最低(86.1%)。系统遗传进化分析表明,SCAU-0901株的gp85基因片段与BJ0303株的亲缘关系最近。

H5亚型禽流感病毒间接免疫荧光快速诊断方法的建立

本研究以当前严重威胁我国养禽业的高致病性禽流感H5亚型病毒为研究对象,病毒在犬肾细胞(MDCK)上培养增殖,经蔗糖梯度离心对病毒进行纯化,免疫清洁级的新西兰公兔,高免血清经辛酸-硫酸铵法和葡聚糖G50柱纯化,制得第一抗体。以FITC标记的山羊抗兔IgG为第二抗体,通过反应条件的优化,建立了间接免疫荧光快速诊断方法。本法的最佳检测组织为心肌和胰腺,检测时间只需3小时,本法可检出人工感染后36小时尚未表现出临床症状鸡只中的病毒,对禽流感H7亚型、H9亚型病、新城疫、传染性支气管炎和传染性喉气管炎禽出败等病料进行特异性检验结果均为阴性。运用本方法对69个禽场的临床病料进行了检测,检测结果与鸡胚分离法进行比对,9个阳性场(广东省2004年9个原疫点的病料)的9份病料中,检出8份阳性;而鸡胚分离法阴性样品,本法检测结果与之完全相符。本法用于禽流感H5亚型病毒的快速诊断具有快速、简便、敏感、特异、费用低廉和不存在交叉污染等优点,在当前流行的H5亚型高致病性禽流感快速诊断中具有良好的应用前景。

牛溶血性曼氏杆菌的分离鉴定

溶血性曼氏杆菌（Mannheimia haemolytica）是引起牛呼吸道疾病综合症（bovine respiratory disease complex,BRDC）,俗称运输热（shipping fever）,的主要病原之一,随着牛、羊肉价格的高启,以及广东省扶持草食动物发展政策的出台,广东省养牛业得到了较快的发展,出现了从各地引进牛的进行饲养的小高潮,各地陆续出现了由于长途运输导致的牛呼吸道疾病综合征疑似病例.

鸭链球菌的分离鉴定及其16S rRNA基因序列分析

从一种表现为脚软、拉稀、死亡增多的新发鸭病病例中分离到1株细菌,命名为GDYJ2011。通过生长特性、染色特性及VITEK-32微生物鉴定系统生化试验鉴定为链球菌,进一步进行16SrRNA基因序列的测定与分析,鉴定为巴氏链球菌。进行人工发病试验,成功的复制出本病,该菌还表现出较强的致病力。结合药敏试验与临床治疗效果,提出了本病的防控措施。

当前主要动物疫病监测抽样数量的探讨

应用流行病学理论,结合以往监测数据,建立相关模型,确定当前常规监测项目的采样数量。为动物疫病预防控制部门的科学监测提供参考。

禽腺病毒Ⅰ群C种4型病毒的荧光PCR诊断方法的建立

心包积水-肝炎综合征(HHS),是由腺病毒科禽腺病毒属Ⅰ群C种4血清型病毒引起的一种鸡新型传染病,对养鸡业危害较大。当前该病的诊断主要依靠普通PCR,敏感性和高通量受到限制。本研究建立了一种Taqman荧光PCR方法,该方法特异性强,敏感性高较普通PCR提高1 000倍,经临床样品验证,本方法适用于临床发病病例的诊断和临床正常鸡只的流行病学调查,并适用于高通量检测。为该病的防控提供了一种有效的手段。

H7N9流感传播的生态学分析及防控对策

自2013年4月华东地区发生H7N9流感疫情以来,H7N9流感已连续4年冬春季节出现流行,严重影响公共卫生安全和沉重打击家禽业发展。通过深入分析活禽批发市场、零售市场和养殖场各环节的生态状况,提出H7N9流行传播的模型,指出活禽市场是控制H7N9病毒的关键环节。结合广东生产实际,从改变病毒生存、传播生态条件着手,提出相应的防控策略。

牛多杀性巴氏杆菌病的诊治

对一个村连续2年出现牛猝死的病例进行诊断。通过细菌分离、生化鉴定和16S r RNA基因序列测定,诊断为多杀性巴氏杆菌引起的牛出败。用荚膜PCR方法进行定型,证实为B型。根据药敏试验结果采用头孢类抗生素进行预防与治疗,结合疫苗免疫,防控效果显著。

一例雏鸡铜绿假单胞菌的分离鉴定及其16SrRNA基因序列分析

为对死亡雏鸡进行病因诊断,通过大体剖检、细菌分离、生化鉴定,证实为铜绿假单胞菌感染。测定了该分离株的16S rRNA基因序列,并与GenBank中收录的序列比较,结果发现所分离的铜绿假单胞菌及参考株的16S rDNA基因序列极其保守,相似性达99%～100%;与大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌的相似性差异约为9%;与鸭疫里默氏杆菌的相似性差异则更大,超过18%,提示16S rRNA序列测定可作为该菌鉴定的一种可靠方法。

广东地区近2年禽流感H_9亚型HA基因的序列分析

通过对2013-2014年从广东地区养鸡场、活禽交易市场获得的12株禽流感H9亚型病毒的HA基因的序列分析,发现当前流行的病毒主要属于H9.4.2.5分支。潜在的氨基酸糖基化位点有7～8个,变异主要表现在HA蛋白的145-147 aa和313-315 aa处增加了2个位点。受体结合位点发生变化,第198位aa由G变为L,具有可感染人的分子特征。以上基因变化提示当前毒株具有了致病力增强的分子基础,且其与疫苗株有较大的差异,提示现有的疫苗不能提供较有效的保护。

无非洲猪瘟小区建设及其难点与注意事项分析

无非洲猪瘟疫区建设是农业农村部推进常态化防控非洲猪瘟的重要举措,非洲猪瘟防控的根本方向。本文通过介绍无非洲猪瘟小区建设的依据、要求和重点,结合广东省无非洲猪瘟小区建设案例实践经验,分析难点弱项,提出解决措施,为广大生猪企业创建非洲猪瘟无疫小区提供参考。

不同日龄黄鸡4种免疫抑制病血清学调查及其与3种疫病免疫效果的相关性分析

在某规模化鸡场的临床健康三黄肉鸡群中,于不同日龄采血,检测禽白血病(AL)AB亚群、J亚群,网状内皮组织增生症(RE)和传染性贫血(CIA)等4种免疫抑制性疫病的感染抗体,以及新城疫(ND)、禽流感(AI)H5亚型和传染性支气管炎(IB)的免疫抗体水平。结果发现鸡群受到ALV-AB、REV和CIAV感染。ALV-AB抗体阳性率为60%,ALV-J亚群抗体未检出,REV为75%,CIAV为100%。NDV免疫后平均抗体水平6 Log2;AIV H5抗体水平达到9.75 Log2;IBV阳性率100%,但在试验过程出现一次隐性感染。对上述7种疫病抗体阳性率或抗体水平进行相关性分析,未能找到明显的相关性规律。

一例犊牛支原体肺炎的诊断

近年来,广东地区草食动物养殖得到了较快的发展,多地从北方新引进犊牛饲养,部分新引进犊牛出现了呼吸道疾病综合征。某牛场从山东引进81头犊牛后,部分犊牛出现发烧,咳嗽、呼吸困难,跛行,拉稀等症状;死亡率达22.2%。经病原分离、PCR检测、16Sr RNA基因序列测定,诊断为犊牛支原体肺炎。证实了广东有该病存在,需引起关注。