PF4对造血干/祖细胞系KG1a总粘附性、粘附分子表达及细胞骨架蛋白聚合的作用

目的研究ＰＦ４单用及与ＩＬ－３联合应用对造血干／祖细胞系ＫＧ１ａ总粘附性、粘附分子表达及细胞骨架蛋白聚合的影响。方法采用结晶紫染色、免疫标记流式细胞仪测定、ＭＴＴ、荧光分光光度等方法。结果１．单用１００ｎｇ／ｍｌ ＰＦ４作用于ＫＧ１ａ细胞时，ＫＧ１ａ细胞总粘附性增长８０％，单用２０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－３作用于ＫＧ１ａ细胞时，ＫＧ１ａ细胞总粘附性增长９６％，ＰＦ４与ＩＬ－３联合作用于ＫＧ１ａ细胞时，ＫＧ１ａ细胞总粘附性增长９７％。２．ＰＦ４作用于ＫＧ１ａ后，ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ表达分别增加了２１％、２２％、１７％、１８％，较前均有显著性（Ｐ＜０．０５＝，而ＰＦ４对ＫＧ１ａ细胞的ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６２Ｅ表达无影响；ＰＦ４与ＩＬ－３联合作用于ＫＧ１ａ时，ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ表达并没出现互相促进作用。３．分别用抗ＣＤ３１、ＣＤ４４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ等单克隆抗体阻断ＫＧ１ａ粘附分子时，对ＰＦ４引起的ＫＧ１ａ粘附性分别下调了３９％、４３％、３４％、３８％。４．ＰＦ４、ＩＬ－３作用ＫＧ１ａ细胞时，能够引起ＫＧ１ａ细胞肌动蛋白的聚合。结论ＰＦ４可刺激早期的白血病性造血干／祖?

血小板第四因子PF4对人中性粒细胞粘附性与呼吸爆发的调节作用

目的研究血小板第四因子PF4对人中性粒细胞Np功能的影响。方法用结晶紫染色、免疫荧光标记、PKC试剂盒测定、NBT法及高香草酸HVA荧光分光光度法比较对照组与PF4作用的实验组在趋化因子刺激前后,PF4对中性粒细胞总粘附性、整合蛋白CD11b的表达、PKC水平及呼吸爆发作用产生活性氧物质reactiveoxygenspeciesROSO2·-、H2O2等的影响。结果PF4对静息中性粒细胞总粘附性有轻度的增强作用使总粘附性上调了12.24%P<0.01,而对整合蛋白CD11b的表达、呼吸爆发产生的ROSO2·-、H2O2则无影响。进一步研究发现PF4使经趋化三肽(FMLP)活化的中性粒细胞的总粘附性下调17.47%P<0.01;使经趋化三肽(FMLP)活化的中性粒细胞的整合蛋白CD11b的表达下调18.84%P<0.01;使经佛波酯(PMA)活化的中性粒细胞的呼吸爆发作用产生的O2·-、H2O2分别下调了50.29%P<0.01、226.53%P<0.05。研究同时发现PF4对静息及活化的中性粒细胞的PKC水平均无影响。结论首次证明PF4与其它经典的趋化因子不同,是中性粒细胞活化的一个负调节因子,对中性粒细胞功能主要起降调节的作用。这种降调节作用不是通过PKC信号转导途径完成的。

血液血管细胞生成素对胎儿骨髓造血和内皮干细胞作用的研究

目的研究人血液血管细胞生成素(hemangiopoietin,HAPO)对胎儿骨髓细胞的作用,探讨其生物学特性。方法采用细胞液体培养、半固体培养、MTT方法、免疫荧光标记流式细胞仪测定、免疫组化、显微镜观察照相等方法。结果在液体培养3周的胎儿骨髓单个核细胞中,HAPO组中出现了大量小而圆的早期造血细胞,其中CD34+细胞含量比对照组高20%,对照组CD34+细胞为1.25×105个,而HAPO组CD34+细胞为3.93×106个。取胎儿骨髓悬浮造血细胞进行半固体培养,对照组不能形成CFU-GEMM,而HAPO组形成CFU-GEMM数达到(11.0±2.6)个;HAPO也协同SCF、IL-3、GM-SCF等生长因子促进集落形成,CFU总数是对照组2.6倍,CFU-GEMM数HAPO组是对照组2.1倍。MTT方法发现,HAPO对胎儿骨髓基质细胞也有促增殖作用,HAPO可使基质细胞增长21%;液体培养的胎儿骨髓基质细胞中,有内皮特异性标志的细胞均增高;在甲基纤维素半固体培养中HAPO使胎儿骨髓内皮细胞的集落数增高,并出现条索状排列的集落,有促进血管形成的趋势。进一步证明HAPO可直接促进CD34+KDR+细胞的增殖。结论HAPO对骨髓造血和血管内皮干细胞均有刺激增殖作用。

脐带间充质干细胞体外分化为有功能的低免疫原性肝细胞样细胞

目的观察人脐带来源的间充质干细胞(UC-MSCs)体外诱导分化为肝细胞样细胞(DHC)后,是否具有肝细胞的生物学特性和功能,以及其免疫原性的变化。方法采用改良的二步法肝细胞分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化,并用RT-PCR和免疫荧光染色法检测诱导后不同时间DHC肝细胞特异性标记的表达;采用ELISA法检测细胞培养液中白蛋白(ALB)和尿素的浓度,以及混合淋巴细胞培养检测DHC对淋巴细胞增殖能力的影响。结果 UC-MSCs低表达甲胎蛋白(AFP)、ALB和细胞角蛋白-19(CK-19)的mRNA和蛋白,成肝诱导分化后14和28dDHC均高表达肝细胞标志AFP、ALB、CK-19以及色氨酸2,3-加双氧酶基因。诱导后的DHC能够以时间依赖方式产生ALB和分泌尿素,不表达人白细胞DR抗原,而且能够抑制淋巴细胞增殖。结论 UC-MSCs在体外能够分化为有功能的DHC且具有低免疫原性的特征。

脐带间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞样细胞的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)体外诱导分化为肝细胞的可行性和方法,观察分化后的细胞白细胞表面抗原表达的改变。方法采用酶学法从脐带全层组织中分离UC-MSCs,采用改良的肝分化培养体系体外诱导UC-MSCs向肝细胞分化。诱导后2、4周,观察细胞形态,免疫荧光细胞化学染色法检测甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB);RT-PCR检测肝细胞标志性基因AFP、ALB和CK19 mRNA。ELISA法检测诱导后的细胞培养液中ALB水平。流式细胞仪检测诱导后细胞白细胞表面抗原HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ。结果从人脐带基质中分离培养的UC-MSCs在向肝细胞诱导分化培养体系的培养下,细胞形态由长梭形逐渐转化成为多角形或类圆形,并且表达AFP、ALB mRNA和蛋白,诱导后的UC-MSCs以时间依赖方式产生ALB,诱导后的细胞不表达HLA-DR。结论UC-MSCs具有向肝细胞分化的潜能,分化后的M细胞仍具有低免疫原性。

人脐血干细胞移植促进大鼠脊髓损伤神经恢复

目的观察移植人脐血CD３４＋干细胞是否可以存活、分化、促进脊髓损伤的行为和功能恢复。方法２６只Wister大鼠随机分成移植组和对照组。移植组行脊髓半切术并移植５-溴脱氧尿核苷（Brdu）标记的脐血CD３４＋细胞，对照组行脊髓半切术后注射PBS液。采用改良Tarlov评分标准对移植组和对照组所有大鼠在术前和术后２４h、１、２、３、４周进行运动功能评价。组织学和免疫组化分析移植细胞的定位和分化情况。结果移植后在脊髓病理切片中出现Brdu标记人脐血细胞，激光扫描共聚焦显微镜通过免疫荧光双标检测到７％Brdu阳性细胞表达神经胶质元纤维酸性蛋白（GFAP），２％Brdu阳性细胞表达神经元核抗原（NeuN）。神经功能检测发现１周后移植组功能恢复较对照组具有显著性差异（P＜０．０５）。结论移植人脐血干细胞可以促进脊髓损伤的行为和功能恢复，为神经损伤治疗提供了有用的细胞源。

新型血友病B基因治疗的腺病毒-整合酶嵌合系统的构建及其体外表达鉴定

本研究构建一种既可高效感染靶细胞又能实现安全定点整合入宿主基因组的腺病毒嵌合载体。通过一系列DNA操作构建腺病毒-整合酶嵌合系统,该系统包含两个腺病毒载体:一个携带转基因表达框,表达框内有hFⅨ,红色荧光蛋白编码序列以及attB(phiC31识别位点),表达框两侧各有1个loxP(Cre识别位点);另一个腺病毒载体携带Cre和phiC31基因。同时构建只表达Cre和只表达phiC31的载体作为对照载体。在体外分别用脂质体转染293A细胞,用荧光显微镜观察荧光蛋白的表达,用RT-PCR鉴定各个基因的表达。结果表明,该腺病毒-整合酶嵌合系统构建成功。体外分别用脂质体转染293A细胞后,可见绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白表达。RT-PCR鉴定表明,该系统能够成功表达各种目的蛋白。结论:成功构建了腺病毒-整合酶嵌合系统,为进一步研究其治疗作用提供良好基础。

小鼠胚胎干细胞在单层粘附培养中向神经细胞的分化

目的 :探讨小鼠胚胎干 (ES)细胞在无血清培养基中以单层粘附培养方式向神经分化的方法。方法 :比较ES细胞在不同培养基中的生长情况 ,分析ES细胞在不同时间分化形成神经细胞的比例。结果 :( 1 )DMEM F1 2和Neurobasal B2 7的 1∶1混合培养基最适合ES的生长。 ( 2 )单层粘附的ES细胞表达神经细胞粘附分子 (NCAM)的比例随时间增长而增加 ,而nestin的表达先增加后下降。 ( 3)ES细胞可在两周分化为神经胶质及神经元 ,形成神经网络。结论 :小鼠ES细胞可在单层粘附培养中获得向神经的高效分化。

抗凋亡蛋白Bcl-x_L在巨核细胞分化和成熟过程中的作用

目的 研究抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化和成熟过程中的作用。方法采用PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化，RNA干扰阻断Bcl-xL在K562细胞向巨核细胞诱导分化中的表达，RT-PCR和流式细胞仪技术检测其改变。采用免疫磁珠从正常骨髓中富集CD34＋细胞，在无血清培养下用TPO诱导其向巨核细胞分化，免疫组织化学和流式细胞仪技术观察分化过程中Bcl-xL的表达改变。结果 PDBu诱导K562细胞向巨核细胞分化24h后，CD61＋细胞百分比迅速增加，并且在72h内维持较高的阳性率；用siBcl-xL干扰后72h内，CD61＋细胞百分比只有轻度增加，同时RT-PCR检测显示24h后Bcl-xLmRNA表达显著减少，流式细胞检测显示Bcl-xL蛋白的表达也相应降低。正常骨髓中CD34＋细胞经TPO诱导后，在培养5—20d间Bcl-xL蛋白表达阴性的巨核细胞随着培养时间延长逐渐增多，免疫组织化学检测显示未成熟的巨核细胞Bcl-xL蛋白表达呈强阳性，而在成熟的巨核细胞中表达为阴性。结论抗凋亡蛋白Bcl-xL在巨核细胞分化过程中发挥重要作用，而在巨核细胞发育晚期Bcl-xL蛋白的表达下调可能是巨核细胞成熟的关键，并与成熟巨核细胞的特殊凋亡发生密切相关。

脐血巨核祖细胞的体外扩增

目的联合血小板生成素(TPO)、白细胞介素-11(IL-11)和肝素用脐血CD34+细胞定向扩增巨核祖细胞。方法采用免疫磁珠法(M ACS)分选CD34+细胞,用TPO、IL-11和肝素定向扩增巨核祖细胞,巨核祖细胞集落分析(CFU-M K)测定巨核祖细胞扩增倍数,流式细胞术检测巨核祖细胞分化过程中不同细胞组群(CD34+、CD41a+、CD61+、CD34+CD41a+和CD41a+CD61+)的变化,免疫组织化学染色(CD41a)和透射电镜观察巨核细胞形态及超微结构,血小板体外活化实验及非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠异种体内移植实验评价扩增的巨核祖细胞功能。结果单用TPO7d时,CD34+CD41a+细胞扩增(4.0±1.7)倍;与IL-11联用后扩增到(10.5±4.8)倍;再加入肝素后扩增达(29.9±6.4)倍,TPO+IL-11+肝素组扩增倍数为TPO组、TPO+IL-11组的7.5、2.85倍,与两组相比差异均有显著性(P<0.05)。TPO+IL-11+肝素组巨核祖细胞中大集落(>50个细胞/集落)达(106.8±26.9)倍,较TPO、TPO+IL-11组均有明显增加(P<0.05)。将扩增第7天的巨核细胞静脉输注于经放射预处理的非肥胖性糖尿病/严重联合免疫缺陷鼠,可明显加速其血小板及白细胞的恢复并提高小鼠生存率。电镜显示扩增的巨核细胞有一定的界膜发育等成熟特征,体外血小板活化实验证实,扩增的巨核细胞在体外可产生血小板。

一种高效诱导胚胎胰腺细胞分化为内分泌细胞培养方法的建立

目的建立一种使胚胎胰腺细胞体外高效分化为成熟内分泌细胞的培养方法。方法体外分离小鼠12.5 d的胚胎胰腺,培养于下层为培养基的漂浮膜上7 d,采用免疫组织化学方法检测胰腺祖细胞标志胰腺十二指肠同源盒基因1(PDX-1)和神经源素3(Ngn3)的表达及内、外分泌细胞的标志胰岛素、胰高血糖素、羧肽酶表达,定量PCR检测培养过程中胰腺标志表达的变化。结果胚胎胰腺培养1 d后,有大量胰腺祖细胞标志表达,且这些胰腺祖细胞处于增殖状态。培养3 d后,仍有胰腺祖细胞的标志大量表达。培养7 d后,分化的胰腺表达成熟内、外分泌细胞的标志,且胰腺标志的表达与体内表达模式一致。结论建立了一种使胚胎胰腺细胞体外高效分化为成熟内分泌细胞的培养方法。

单克隆抗体HIM_(82)对中性粒细胞呼吸爆发的降调节作用

本研究用单抗HIM82对中性粒细胞（PMN）呼吸爆发的早期调控，发现HIM82（30μg／ml）对佛波酯（PMA）激活的PMN产生的O2-、H2O2分别可下调至（44．00±8．9）％（n=8，P＜0．01）和（65．16±15.41）％（n=8，P＜0．01），对因呼吸爆发产生的活性氧物质（reactiveoxygenspecies，ROS）引起质膜中性内肽酶（NEP）的纯化作用（inactivation）[活性下降（43．29±9．41）％，n＝8，P＜0．01]有防护作用[活性恢复至（6648±15.53）％，n=8，P＜0．05]。结果表明该单抗对PMA激发PMN呼吸爆发产生O2-、H2O2有明显的降调节作用，也表明质膜上相应分化抗原分子对PMN功能特别是对激活呼吸爆发的机构有重要影响。

胎儿真皮间充质干细胞中的全能性相关转录因子的表达

背景:人真皮纤维母细胞或间充质干细胞可形成诱导性多能干细胞,但不同研究者所用的转录因子组合却并不相同。目的:分离人胎儿真皮间充质干细胞,检测其全能性相关转录因子的表达。方法:水囊引产5月龄胎儿,按照既往分离培养间充质干细胞的方法,得到胎儿真皮间充质干细胞。结果与结论:胎儿真皮间充质干细胞高表达Oct4和C-myc、中度表达Sox2,是形成诱导性多能干细胞较好的体细胞。

用组织块培养法从骨髓滤网颗粒物中分离大量骨髓间充质干细胞

本研究探讨能否从废弃的骨髓滤网颗粒物中获得间充质干细胞(MSC)。应用组织块培养法,对2例正常供者骨髓滤网中的颗粒物进行分离培养,计数获得的MSC数量,对其表型和分化能力进行鉴定。结果表明:骨髓滤网颗粒物中存在大量的MSC,经过3代扩增后其数量接近107;这些细胞具有典型的MSC形态和表型特征,可以分化为骨、软骨和脂肪细胞。结论:用组织块培养法可以从骨髓滤网颗粒物中获得大量MSC。

胎儿和成人骨髓间充质干细胞体外造血支持能力的比较(英文)

胎儿出生以后,造血干细胞(HSC)才从胎儿的肝脏和脾脏转移到骨髓,这一过程可能由不同的造血微环境中的信号分子所介导。间充质干细胞(MSC)是骨髓微环境中间质细胞如成骨细胞、内皮细胞的前体祖细胞。研究者推测,胎儿出生前的骨髓可能并不特别适合HSC生长。然而,该假说尚缺乏直接的证据支持。本研究通过对胎儿和成人骨髓MSC的造血支持能力进行比较,拟为此提供证据。成人骨髓MSC来源于3位健康供者,胎儿骨髓MSC来源于孕19-20周流产的胎儿。MSC辐照后与CD34+一起进行长期培养启动细胞分析,计数克隆形成细胞的数量,流式分析培养后CD34+的表型变化。RT-PCR分析两种MSC中细胞因子的表达。结果显示,成人骨髓MSC比胎儿骨髓MSC具有更强的造血支持能力,两者都促进CD34+向髓系细胞分化,两者之间细胞因子的表达存在差异。结论:与胎儿骨髓MSC相比,成人骨髓MSC在某些治疗,尤其是促进造血恢复方面具有更广泛的应用前景。

脐血中性粒细胞上清液对脐带间充质干细胞增殖及白细胞介素-6分泌的影响

目的:探讨脐血中性粒细胞上清液对脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)增殖、白细胞介素-6(IL-6)分泌的影响。方法:分离脐血中性粒细胞,UC-MSCs在不同浓度的中性粒细胞上清液中培养为实验组,UC-MSCs和中性粒细胞的比例分别为1∶1、1∶10、1∶50、1∶100,UC-MSCs单独培养为对照组(1∶0)。在分别培养18h和40h后,用MTT法检测各组增殖,评价不同组间的增殖情况,用ELISA方法检测不同组间培养上清IL-6水平。结果:1∶50和1∶100组UC-MSCs生长受到抑制(P<0.05),18h和40h差异无显著性(P>0.05)。1∶50实验组中,IL-6的分泌水平低于1∶0和1∶1实验组(P<0.05)。结论:高浓度的脐血中性粒细胞上清液抑制UC-MSCs的增殖。高浓度的脐血中性粒细胞的上清液抑制人UC-MSCs分泌IL-6。

反义血管内皮生长因子原位表达抑制白血病细胞系K562在裸鼠体内生长并诱导其凋亡

目的观察反义血管内皮生长因子(anti-VEGF)原位表达对白血病细胞系K562在裸鼠体内生长的影响。方法选用白血病细胞系K562裸鼠体内接种成瘤后,肿瘤内注射重组反义VEGF真核表达质粒及空载体和PBS,检测反义VEGF体内转染情况及其对肿瘤生长的影响;免疫组化法比较实验组和对照组移植瘤微血管密度(MVD)及白血病细胞的凋亡情况。结果注射反义VEGF表达质粒能抑制肿瘤的生长,使肿瘤的MVD显著降低(25.6±5.77VS41±3.8,P<0.05),并且使肿瘤细胞凋亡增加。结论肿瘤内注射反义VEGF重组表达质粒在体内能有效转染肿瘤及其周围组织,反义VEGF体内的表达能抑制白血病细胞肿瘤的生长,降低肿瘤内MVD,促进白血病细胞的凋亡。反义VEGF基因治疗策略提供了一种新的白血病辅助治疗方案。

人脐带间充质干细胞分泌白介素-6对白血病细胞分化的影响

目的探讨脐带来源的间充质干细胞(UC-MSC)对白血病细胞分化的影响。方法体外建立UC-MSC与急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4细胞共培养体系,通过细胞形态、硝基四唑氮蓝还原实验和细胞表面粒系分化标志CD11b的检测,评价肿瘤细胞的分化状态。结果 UC-MSC在体外能够诱导NB4细胞向粒系分化成熟并和小剂量全反式维甲酸共同应用时存在诱导作用联合增强。白介素(IL)-6Ra中和阻断IL-6作用后可部分逆转UC-MSC的促分化作用,外源性IL-6对NB4细胞发挥促粒系分化作用。结论 UC-MSC通过分泌IL-6可以诱导急性早幼粒细胞白血病细胞向粒系分化成熟,且和小剂量全反式维甲酸同时应用可以达到诱导分化作用联合增强。

人促血液血管细胞生成素的原核表达及兔抗体的制备

目的:表达人促血液血管细胞生成素(hemangiopoi-etin,HAPO)蛋白并制备兔抗HAPO抗体。方法:利用硫氧还原蛋白TrxA融合表达载体(pET32c),表达可溶性HAPO。表达的HAPO融合蛋白经亲和层析快速纯化,并通过Westernblot进行鉴定。以纯化的人HAPO免疫新西兰大白兔,制备抗体并测定其效价。结果:获得高效表达并纯化的HAPO蛋白。制备的兔抗人HAPO抗体的免疫双扩散的效价为1∶8。结论:建立了HAPO基因的原核表达载体和快速纯化体系并制备出兔抗HAPO的抗体,为研制检测HAPO的ELISA试剂盒奠定了基础。

牙胚组织中可分离得到大量间充质干细胞

背景:已经有研究从牙髓、牙囊和牙周组织中分离得到间充质干细胞。牙胚是牙的前体,能否从中直接分离间充质干细胞,目前未知。目的:从人流产胎儿牙胚中分离间充质干细胞,检测其生物学特征。方法:无菌条件下挖出水囊流产胎儿牙床中的整个牙胚,剪碎后分别用胶原酶Ⅱ和胰酶消化,过滤除去颗粒物后,细胞悬液用培养液洗涤,培养、扩增得到贴壁细胞,进行细胞形态学观察、免疫表型测定和多向分化功能鉴定。结果与结论:经过3次传代后,从单个胎儿牙胚中即可获得超过107形态均匀的、梭形贴壁细胞,其表达CD105、CD73、CD90和CD44等表面标志,不表达CD34、CD45标志;在体外向成骨、成脂分化,在体内可以分化为软骨细胞。提示用贴壁法可从人胎儿牙胚中分离得到大量的间充质干细胞。