猪源屎肠球菌致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性分析

为研究猪源屎肠球菌的致病力与耐药性及生物被膜形成能力的相关性,本研究分别对9株猪源屎肠球菌进行动物试验、药敏试验和生物被膜形成能力的测定。结果显示有66.67%的菌株引起小鼠肝脏、脾脏出血等病变,并且其中部分菌株导致接种小鼠急性的高死亡率;9株屎肠球菌中KF-QX-1株耐药率最高为100%,其次为ZKXH01(95.24%)、NY01(90.48%)、NY-XY-4(80.95%)、SBLH(76.19%)、HUAX(71.43%)、NY-XY-1(71.43%)和ZHENGY(66.67%),耐药率低于50%的菌株只有JY02(14.29%);生物被膜检测结果显示9株菌中除NY01株外均有不同程度的的被膜形成能力,其中2株菌(JY02和NY-XY-1)生物被膜形成能力相对较强;通过对上述试验结果综合分析显示,肠球菌菌株对受试动物的致病力与其耐药性和生物被膜形成能力之间缺乏明显的相关性,但具有生物被膜形成及耐药两种特性会增强猪源肠球菌的耐药性和传播性,给人类和动物的疾病控制造成更大的威胁。

鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性

为研究鸭源鸡杆菌(G.anatis)体外黏附和侵袭细胞的能力,选择HeLa细胞为感染模型,分别以细菌黏附和侵袭HeLa细胞数量为指标,借助革兰和姬姆萨染色及电镜观察来研究2株不同来源的鸭源鸡杆菌对HeLa细胞的黏附和侵袭特性。结果显示:黏附计数表明鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附HeLa细胞,菌株感染30、60、90、120、150min后每细胞黏附的细菌数分别为0.84、4.68、8.52、9.27、8.2个,而菌株F149T对HeLa细胞有较低的黏附作用。侵袭试验表明Yu-PDS-RZ-1-SLG有低度侵袭力,侵袭的细菌数在150min时达到最大,约8.27·1 000细胞-1,随后细胞破碎,细胞逐渐脱落,而菌株F149T未检测到侵袭力。染色及电镜试验进一步证实鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG可黏附于HeLa细胞表面并侵入细胞内部。菌株经胰蛋白酶处理后,细菌的黏附率显著降低,表明细菌的表面蛋白参与黏附。黏附和入侵特性是鸭源鸡杆菌定殖在组织表面重要的能力,该细胞模型的建立为进一步研究其致病机制提供了条件。

鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞作用

为研究鸭源鸡杆菌对鸡原代输卵管上皮细胞的作用,分别以细菌黏附、侵袭试验及借助姬姆萨染色及扫描电镜观察2株不同来源的鸭源鸡杆菌对输卵管上皮细胞的黏附和侵袭特性。黏附计数表明鸭源鸡杆菌Yu-PDS-RZ-1-SLG能高水平黏附输卵管上皮细胞,而菌株F149T对输卵管上皮细胞有较低的黏附。庆大霉素保护试验结果显示2株菌对输卵管上皮细胞均无可见侵袭力。姬姆萨染色及扫描电镜试验进一步证明输卵管上皮细胞表面有细菌黏附,而内部未见有侵袭的细菌,但Yu-PDS-RZ-1-SLG株接种细胞90min后,细胞逐渐破碎脱落,而菌株F149T则未见明显细胞损伤。菌株经胰蛋白酶处理后,细菌的黏附率显著降低,表明细菌的表面蛋白参与黏附。ELISA法检测鸭源鸡杆菌感染输卵管上皮细胞后炎性细胞因子的变化,结果表明感染组的IL-6、TNF-α、IFN-γ的含量均高于对照组,且Yu-PDS-RZ-1-SLG感染的细胞所分泌的各细胞因子均高于F149T,提示炎性细胞因子的分泌可能改变局部的微环境,促进细菌在输卵管细胞表面增殖,是造成输卵管上皮细胞损伤的机制之一。

鸭源鸡杆菌致病力与生物被膜形成能力及耐药性的相关性分析研究

为探究鸭源鸡杆菌的致病力与生物被膜形成能力及耐药性的相关性,分别对20株鸭源鸡杆菌进行动物致病性试验、生物被膜形成能力的测定和药敏试验。动物致病性试验显示有80%的菌株能引起小鼠死亡,出现肝脏、脾脏肿大和输卵管出血等病变,且其中部分菌株(YZ-11-XZ、LH-BJT-11-SLG、Huang-1-SLG)导致迅速的高死亡,48h内死亡率100%;生物被膜检测试验结果显示大部分鸭源鸡杆菌均具有不同程度形成被膜的能力,其中3株菌(SHANXY-1-GZ、Huang-1-SLG、ZZ-HL-1-SLG)具有中等被膜形成能力,2株菌(YZ-11-XZ、F149T)具有较强的生物被膜形成能力;药敏试验结果表明,除标准株F149T对多种抗生素都敏感外,其余菌株耐药率均在38.10%~76.19%之间不等。其中LH-BJT-6-XZQ株耐药率为80.95%,其次是XX-HJ-6-QG(76.19%)、ZZ-XC-7-QG(76.19%)、SX-YC-7-QG(71.42%)、ZZ-XY-1-QG(66.67%)、Huang-1-SLG(66.67%)、XX-HJ-6-SLG(61.90%)、ZZ-HL-1-SLG(61.90%)。分析发现,鸭源鸡杆菌对受试动物的致病力与生物被膜形成能力及其耐药性之间缺乏明显的相关性,但具有生物被膜形成及耐药2种特性会增强鸭源鸡杆菌的耐药性和传播性,给动物的疾病控制造成更大的威胁。该研究为鸭源鸡杆菌致病机制的研究提供一定的参考依据。

鸭源鸡杆菌flfA基因的克隆表达及抗原性分析

用PCR方法从鸭源鸡杆菌中国分离株PDS-RZ-1-SLG中扩增flfA基因，并运用生物信息学软件分析鸭源鸡杆菌菌毛蛋白FlfA的二级结构、表面可及性与B细胞优势表位簇；将目的基因插入原核表达载体Pet28a（＋），经PCR、酶切及测序鉴定成功构建重组表达质粒pET28a（＋）-FlfA，然后转化到大肠杆菌BL21，IPTG诱导重组质粒表达；SDS-PAGE和Western blot鉴定FlfA的表达及抗原性。结果显示：成功获得与预期大小一致的573bp的flfA基因；FlfA蛋白结构分析显示其二级结构以无规则卷曲为主，表面存在很多抗原表位；PCR及酶切等鉴定表明重组表达质粒pET28a（＋）-FlfA构建成功。SDS-PAGE分析显示，经IPTG诱导表达获得相对分子质量约20000的重组蛋白；Western blot分析结果显示重组菌毛蛋白能被兔抗rFlfA多抗血清和鸡抗鸭源鸡杆菌血清识别，抗原性良好；而且，rFlfA多抗血清与菌毛蛋白具有良好反应性。

鸭源鸡杆菌外膜蛋白W基因克隆及结构与功能分析

参考GenBank中鸭源鸡杆菌(Gallibacterium anatis,G.anatis)UMN179的外膜蛋白W(outer membrane protein W,OmpW)基因序列设计1对引物,对鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG株的OmpW基因进行克隆、测序,并通过生物信息学软件对该蛋白结构与功能进行分析及预测。结果显示:OmpW基因大小为705bp,编码234个氨基酸;与鸭源鸡杆菌UMN179株、F149株及12656/12株的OmpW氨基酸同源性分别为88.9%、78.7%和79.6%;OmpW相对分子质量为25 300,等电点为7.88,是能够稳定存在的蛋白,N端有1个疏水性的α螺旋信号肽,C端有1个疏水性的β折叠区域,并且在外膜表面存在1个保守性的B细胞线性表位。本试验成功克隆了鸭源鸡杆菌PDS-RZ-1-SLG株的OmpW基因,并对其结构与功能进行初步分析和预测,为进一步研究其生物学功能及其应用奠定基础。