多拷贝脑钠肽基因表达质粒的构建及其表达

目的构建多拷贝脑钠肽(BNP)基因重组表达质粒,并探讨BNP基因的拷贝数与其表达水平的相关性。方法通过人工合成和PCR技术扩增BNP基因,将其克隆至载体pCW111中,构建表达质粒pBNP11,并通过亚克隆构建含有不同数量表达盒的正向串联表达质粒,分别转化大肠杆菌DH5α和BL21(DE3),经温度诱导表达,SDS-PAGE分析,并经激光扫描测定目的蛋白的表达量。结果测序及酶切鉴定证明1～3拷贝BNP重组表达质粒构建正确,重组蛋白在大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)中均可获得表达,表达量分别为菌体总蛋白的8.12%、9.94%、和9.18%。结论已构建了多拷贝BNP的重组表达质粒,BNP的表达水平随BNP拷贝数的增加而升高,但并未成倍增加。

单纯疱疹病毒II型糖蛋白G主要抗原表位的表达和抗原性检测

利用PCR拼接技术，合成含单纯疱疹病毒II型糖蛋白G（gG2）抗原表位（氨基酸序列第561～578位）的片段，并进一步利用基因工程技术获得该表位的双拷贝片段，克隆入pET—KDO表达载体进行原核表达。经IPTG诱导后，高效表达出分子量大小约为39kDa的融合蛋白，经Western blot检测具有良好的抗原性。表达的融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析纯化，得到双拷贝gG2（561～578aa）目的蛋白，经ELISA检测具有良好的灵敏度和特异性。该重组抗原的构建和表达可用于HSV-2特异性血清学诊断的研究。

链球菌制剂对链脲佐菌素诱导小鼠高血糖作用的影响

目的探讨A群链球菌制剂对BALB/c小鼠血糖和链脲佐菌素诱导小鼠高血糖的影响。方法取正常BALB/c小鼠,给予不同剂量的A群链球菌制剂处理,观察对小鼠的血糖及糖耐量的影响;用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射普通小鼠诱导高血糖,再注射链球菌制剂观察小鼠血糖的变化,并比较各组血清胰岛素水平的差别。结果注射链球菌制剂的BALB/c小鼠血糖较对照组(给予0.9%氯化钠溶液)显著降低;经链球菌制剂预处理的BALB/c小鼠的血糖值在口服葡萄糖后比对照组显著下降;链脲佐菌素处理前或处理后注射链球菌制剂,小鼠的血糖值均比单用链脲佐菌素处理的小鼠明显升高。结论链球菌制剂可降低BALB/c小鼠的基础血糖值,改善其糖耐量,与链脲佐菌素合用增强诱导小鼠高血糖的作用。

抗肿瘤新药康赛宁治疗多种癌症的临床研究

康赛宁治疗癌症病人929例。单用康赛宁治疗肺癌、消化系统癌、乳腺癌、鼻咽癌及膀胱痛分别有20.4％、33.3％、26.1％、33.3％及66.7％肿瘤灶部分缓解及不同程度肿瘤灶完全缓解。皮下、瘤内注射是使用康赛宁的两个主要途径,静脉点滴、穴位注射及膀胱灌注则是皮下、瘤内注射途径的补充。胸腔或腹腔注射康赛宁治疗恶性胸水及恶性腹水的有效率分别为91.0％及92.6％,是目前治疗恶性胸、腹水最有效方法之一。康赛宁的副反应主要有一过性发热及轻度局部红肿痛,联合化疗、放疗治疗肿瘤不但增强化疗/放疗的疗效,而且降低化疗、放疗对机体的毒性作用。故康赛宁是治疗癌症的一种安全、有效的药物。

康赛宁Ⅱ期及Ⅲ期临床试验结果的分析

对康赛宁Ⅱ期临床试验与Ⅲ期临床试验的疗效及毒副反应作比较,发现从皮下、瘤内、胸腔注射等途径使用康赛宁,Ⅲ期临床的疗效(缓解率分别7.8％、47.6％及有效率95.8％)比Ⅱ期临床的疗效(缓解率分别1.9％、15.4％及有效率83.0％)要好。康赛宁联合化疗治疗肿瘤,从皮下、瘤内途径治疗Ⅲ期临床(44.9％部分缓解,11.5％完全缓解)比Ⅱ期临床(41.7％部分缓解,5.6％完全缓解)有效。扩大使用范围的Ⅲ期临床,其发热、局部反应及皮疹副反应比Ⅱ期临床减少、减轻。没有观察到其它副反应及器官毒性反应,认为康赛宁是治疗肿瘤的安全、有效药物。

Glypican-3的真核表达及单克隆抗体的制备

目的:建立能够稳定表达人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3,GPC3)的细胞株,制备抗人GPC3的单克隆抗体(mAb)。方法:利用脂质体技术将GPC3重组质粒导入NIH3T3细胞,RT-PCR检测;以原核表达的GPC3片段为免疫原,经传统的杂交瘤技术获得稳定分泌抗免疫原的mAb细胞株,Westernblot和免疫荧光技术鉴定mAb特性。结果:成功获得一株稳定表达GPC3的细胞株,即NIH3T3-GPC3;建立5株能稳定分泌抗原核表达GPC3片段抗原的mAb细胞株。mAb细胞株的免疫球蛋白亚类是IgG2a。间接ELISA、West-ernblot和免疫荧光实验的结果证明,仅杂交瘤GPC34H11能分泌与完整的人GPC3蛋白结合的mAb。结论:建立稳定表达GPC3的鼠源模型细胞株;获得识别天然GPC3分子的mAb细胞株。

康赛宁Ⅲ期临床病例生存质量、WBC、Hb的分析

应用计算机对康赛宁治疗前后的生存质量、白细胞、血红蛋白进行了Ridit分析,结果表明:单用康赛宁皮下及胸腹腔治疗组的生存质量治疗后有显著性提高;但单用康赛宁瘤内给药组和合用放/化疗给药组生存质量治疗前、后差异无显著性(P>0.05)。无论单用康赛宁组还是与化/放疗合用组,其白细胞治疗前、后均没有显著性差异。对血红蛋白单用组分析无显著性差异;但在与化疗/放疗合用时有显著性下降。

康赛宁Ⅲ期临床资料的计算机处理

报道应用计算机对康赛宁Ⅲ期临床病例(521例)进行存储、分类和统计。

链球菌制剂对NOD鼠胰岛瘤细胞株NIT生长影响的体外研究

为了研究A群溶血性链球菌制剂对NOD鼠胰岛细胞瘤细胞株N IT体外生长的影响,利用不同浓度的制剂处理体外培养的NOD鼠胰岛细胞瘤细胞株N IT和正常小鼠胰岛β细胞,以不加药物的培养孔作为对照来对细胞进行形态学观察.以M TT法检测细胞活性,经A garose ge l电泳分析DNA ladder条带检测凋亡,结果表明:A群溶血性链球菌制剂能显著抑制N IT细胞增殖,而对正常胰岛β细胞没有影响,且该制剂有促N IT细胞凋亡的作用.

猪β防御素1基因在毕赤酵母中的分泌表达

PBD-1是猪防御系统起重要作用的抗菌小肽,为实现其在毕赤酵母中的表达,根据已发表的猪β防御素1(PBD-1)氨基酸序列和酵母偏好密码子,用PCR方法获得PBD-1基因,克隆到分泌型表达载体pPIC9K信号序列α因子之后,构建重组表达质粒pPIC9K-PBD-1,用SalⅠ将其线性化后转化毕赤酵母SMD1168,采用PCR法筛选Mut+表型,在AOX1启动子调控下,分子量约4.5kD的PBD-1抗菌肽得到表达。抗菌特性研究表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性。首次在毕赤酵母表达系统中实现了PBD-1的分泌表达。

小学低年级语文课内与课外阅读有效结合策略

随着新课改的加快推进,教师对培养学生的核心素养越发重视,旨在端正学生的学习态度,并帮助学生培养广阔的视野和创新精神。在小学低年级阶段的语文教学中,教师应创新理念,优化教学,通过课内阅读和课外阅读的有效结合培养学生的语文理解能力,提升学生的语文综合素养。文章分析了小学语文低年级阶段课内阅读与课外阅读相结合对语文教学的重要意义,并提出在小学低年级语文教学中课内阅读与课外阅读相结合的有效策略,以期推进学生阅读成长,发展学生的语文能力。

基于深度学习的整本书阅读目标制定及实施--线上教学案例分析

2017年高中语文课程标准提出了“整本书阅读”。在教学过程中想要真正凸显整本书阅读的育人功能,教师应在适度预设课程的同时,注重适时生成,让学生的阅读有目标、有方法。本文以一堂导读课为例,介绍了如何把整本书阅读的目标要求落到实处。

乐读 悦读 阅读——小学语文教学中阅读能力培养策略探究

伴随着全国教育水平的不断提高,为了给小学语文课堂灌输新的动力,也为了让语文课堂教学的效率得到提升,如何在教学中更加有效地培养学生的阅读能力就显得尤为重要。如今,语文教师也在不断地探索新的教学手段与教学方法,努力去提升语文课堂的教学质量,然而效果最明显的便是让学生能够主动提升自己的阅读能力,这样的方法不仅能够提升学生阅读文章的速度,而且对提高学生充分理解文章中心意思的能力也有很大的推进作用。因此,教师需要在平时的教学中更加注重对学生阅读能力的培养,希望通过本文能够给广大的教师和教育研究者们提供一些帮助。

梅毒螺旋体重组抗原的表达及在梅毒血清学诊断中的应用

目的:克隆、表达梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)膜蛋白TpN47、TpN17、TpN44.5和TpN15,建立双抗原夹心ELISA法,探讨其在梅毒血清学诊断中的应用。方法:应用聚合酶链反应法(PCR)从Tp全基因组中扩增4个目的片段,克隆到载体pET-HT-JKM中,在BL21(DE3)plysS菌中诱导表达,Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白,辣根过氧化物酶标记,双抗原夹心酶联免疫吸附法检测人血清中的特异性IgM和IgG抗体。结果:成功表达了4种重组蛋白用作ELISA包被和酶标抗原检测国家Tp参比血清,特异性和灵敏度均为100%;检测385份临床血清样本,结果与TPPA法相比符合率达到99%(P<0.01),灵敏度和特异性分别为98.2%(162/165)和99.5%(219/220)。结论:表达的4种重组抗原具有很好的生物活性,为理想的梅毒的血清学诊断用抗原。以这4种表达蛋白为基础建立的双抗原夹心ELISA法灵敏度高,特异性好,而且方法简单,结果客观,易于自动化操作,值得临床大力推广。

链球菌制剂对NOD鼠自身免疫性糖尿病的预防作用

目的:研究A群溶血性链球菌制剂对NOD小鼠(自身免疫性糖尿病的动物模型)糖尿病的预防作用。方法:用制剂0.1mg皮下注射5周龄♀NOD小鼠,每周一次,共16周,观察其对小鼠胰岛β细胞损伤程度和糖尿病发病率的影响;以小鼠淋巴细胞为效应细胞,NOD小鼠胰岛细胞瘤NIT细胞为靶细胞,通过乳酸脱氢酶试验研究实验组与对照组细胞毒作用的差异。结果:30只链球菌制剂处理组♀NOD小鼠无发病鼠,而20只生理盐水对照组的糖尿病发病率达55%;组织切片检查发现实验组小鼠β细胞损伤程度减轻;发病的NOD小鼠淋巴细胞对NIT细胞的细胞毒作用明显,与实验组比较差异显著。结论:本实验结果证实A群溶血性链球菌制剂能有效预防NOD小鼠自身免疫性糖尿病的发生,提示该制剂可望成为Ⅰ型糖尿病有效的防治手段之一。

人乳头瘤病毒HPV31型宫颈癌细胞模型的建立

宫颈癌与人乳头瘤病毒感染密切相关,建立宫颈癌实验模型可为宫颈癌的研究提供理想的模拟实验条件。我们通过应用基因重组技术,分别以HPV31型E6和E7基因为目的基因,通过原核表达、蛋白纯化和免疫小鼠等获得其特异性检测抗体。我们还通过构建E6和E7基因真核表达载体、转染C33A细胞、博莱霉素抗性筛选和表达检测等步骤,获得一种稳定的体外宫颈癌细胞系。经酶切鉴定及测序证实细胞基因组已重组插入质粒中的目的基因。我们已成功筛选到稳定的目的mRNA和蛋白表达的阳性细胞系,建立了稳定的人乳头状瘤病毒31型(HPV31)的宫颈癌细胞株,为研究宫颈癌提供了体外实验模型。

HER-2/neu基因探针的制备及特异性分析

目的筛选、制备乳腺癌标志基因——HER-2/neu的标记探针,利用间接荧光原位杂交(FISH)技术,探索其临床应用价值。方法通过文库构建、多级筛选、PCR鉴定、序列分析等技术获得HER-2/neu基因组片段,缺口转移法制备生物素标记探针,与生物素-亲和素放大系统和多种荧光显色系统组合,针对病理标本、细胞涂片进行间接FISH检测。结果制备的HER-2/neu基因探针可以特异性地检测乳腺癌阳性、胃癌阳性病理片,也可以特异性检测阳性、阴性细胞标本,并与不同的荧光显色系统结合使杂交信号可以选择性地呈现绿色或红色荧光。结论高特异性的HER-2/neu基因探针和灵活的显色系统为FISH的临床应用奠定了基础。

MHC分子在诱导口腔鳞癌CTL中的作用

目的 探讨肿瘤细胞上的主要组织相容性复合体 (majorhistocompatibilitycomplex ,MHC)分子在诱导自体口腔鳞癌细胞毒T淋巴细胞 (cytotoxicTlymphocyte ,CTL)中的作用。方法 对 9例口腔鳞癌中的肿瘤细胞表面人类白细胞抗原 (humanleukocyteantigen ,HLA) ABC和HLA DR抗原进行检测 ,将其中 5例HLA ABC抗原表达 >5 0 %和HLA DR抗原表达 >35 %的病例作为研究对象 :①自体肿瘤细胞经处理后作刺激细胞 ,并用MHC单抗阻断刺激细胞上的HLA ABC和 (或 )HLA DR抗原 ,检测自体肿瘤细胞诱导的CTL的特异性杀伤活性及肿瘤坏死因子 (tumornecrosisfactor,TNF) α的分泌水平。②阻断靶细胞上HLA ABC和 (或 )HLA DR抗原 ,观察MHC单抗对自体刺激细胞 (未加单抗处理 )诱导的CTL细胞毒的抑制作用。结果 ①各病例的各实验组刺激细胞诱导的CTL杀伤活性均显著低于对照组 ,依次为 :DR抗原阳性刺激细胞组 >ABC抗原阳性刺激细胞组 >ABC和DR抗原均阴性刺激细胞组 ,抗ABC单抗可完全阻断CTL特异性分泌TNF α ;②各实验组单抗对CTL的杀伤活性的平均抑制率分别为 :抗ABC单抗为 5 2 % ;抗DR单抗为 2 7% ;抗ABC单抗 +抗DR单抗为 72 %。 结论口腔鳞癌细胞上的MHC I。