原花青素下调miR-181a抑制颗粒细胞氧化损伤的作用机制

旨在研究葡萄籽原花青素(grape seed procyanidins, GSP)抑制颗粒细胞氧化损伤的作用及其可能机制。腹腔注射3-硝基丙酸(3-nitropropionic acid, 3-NP)诱导小鼠卵泡氧化损伤,并补充GSP进行干预处理;体外分离培养小鼠卵巢颗粒细胞,通过抑制或过表达miR-181a,研究原花青素B2(grape seed procyanidin B2,GSPB2)通过下调miR-181a抑制颗粒细胞氧化损伤的作用。采用定量PCR方法检测miR-181a表达水平,应用四甲基偶氮唑盐(methylthiazolyl tetrazolium, MTT)法检测细胞活力,利用免疫组化法检测活化天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3),应用酶标仪法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)活性,采用双荧光素酶报告基因检测miR-181a和转化生长因子β受体Ⅰ(TGFBR1)的靶向调控关系,使用原位末端标记法(TUNEL)染色检测颗粒细胞凋亡情况,应用Western blot法检测TGFBR1蛋白水平。结果显示:在动物试验中,与对照组相比,3-NP组颗粒细胞活力显著降低(P<0.05);同时caspase-3活性、cleaved caspase-3蛋白及miR-181a表达明显升高(P<0.05);而GSP干预处理可扭转上述各指标的改变(P<0.05)。双荧光素酶报告试验结果显示,TGFBR1为miR-181a的靶基因;进一步分析发现,与对照组相比,miR-181a模拟物转染后TGFBR1蛋白表达和细胞活力均显著降低(P<0.05),而miR-181a抑制剂转染后TGFBR1蛋白表达和细胞活力均显著升高(P<0.05)。在细胞试验中,与对照组比较,H2O2组细胞中miR-181a表达升高,TGFBR1表达降低(P<0.05),细胞活力下降,caspase-3活性和细胞凋亡率均显著升高;而GSPB2预处理可扭转上述各指标的改变(P<0.05)。综上,GSP可抑制颗粒细胞的氧化损伤,其作用可能是通过抑制miR-181a表达而调控TGFBR1表达实现。

基于p72蛋白的非洲猪瘟病毒抗体检测试纸研制

为了研制灵敏、准确、特异及稳定的非洲猪瘟抗体快速检测试纸产品,以非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白为检测抗原,以金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)为拦截线,对比重组蛋白p72的不同状态对试纸检测性能影响,优化标记条件、喷膜浓度、样品垫缓冲体系及成分、显色时间等因素,确定ASFV抗体检测试纸产品化的具体参数,并对试纸的特异性、均一性、准确性及稳定性进行鉴定。结果显示,试纸的检测敏感性为1∶51200,优于商业化ASFV检测试剂盒,与其他猪源病毒阳性血清无交叉反应,变异系数小于10%,在临床样本检测中未见假阴性及假阳性结果,具有良好的敏感性、特异性、均一性及准确性;经加速稳定试验验证,可以室温保存1 a以上;与进口商品化试剂盒的总符合率为91.6%。综上,成功研制了ASFV抗体检测试纸,且试纸的检测性能良好,可以用于ASFV抗体的快速筛查。

河南省主要农作物种业发展建议

河南省是农业大省和粮油生产大省,为我国粮油稳产保供作出了重要贡献。种子是农业的“芯片”,是确保国家粮食安全和农业高质量发展的“源头”。文章综述了河南省在主要农作物理论技术创新和新品种培育、种业创新平台建设、种业创新人才培育等方面取得的成效,分析了主要农作物种业发展面临的新形势与存在的主要问题,并针对种业发展提出了进一步优化种业发展政策、打造种业战略科技力量、建设区域性资源保护与利用中心等建议,以期为河南省种业高质量可持续发展提供参考。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白间接ELISA检测方法的建立

以原核表达经纯化复性制备的A型口蹄疫病毒(FMDV)VP1蛋白代替传统病毒抗原包被,建立快速、安全、有效的A型FMDV抗体ELISA检测方法。对前期制备的A型VP1蛋白进行Western-Blot检测,结果表明,VP1蛋白能够特异性识别A型FMDV阳性牛血清,可作为检测抗原建立检测A型FMDV抗体的方法。以最佳质量浓度1mg/L VP1蛋白为检测抗原,方阵滴定法确定最佳检测血清稀释度为1∶50[V(血清)∶V(封闭液)],最佳的酶标二抗稀释度为1∶2 000[V(酶标二抗)∶V(封闭液)],建立A型FMDV抗体ELISA检测方法。该方法的敏感性为94.32%,特异性为99.09%,批内与批间重复试验变异系数均小于8%。采用该方法检测201份临床血清,与液相阻断ELISA试剂盒的符合率达92.54%。研制的VP1-ELISA试剂盒特异、敏感、稳定、操作简便,可用来监控A型口蹄疫抗体水平。

禽腺病毒血清4型SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4,FAdV4)临床检测方法,根据GenBank中该病毒Hexon基因序列设计扩增引物,将扩增的Hexon基因连接至pEASY-Blunt载体,构建重组质粒pEASY-Blunt-Hexon,同时对Hexon基因进行分析,选取高度保守区域,设计荧光定量检测引物,建立FAdV4 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法扩增产物长度为95 bp,最低检测下限为7.1×102拷贝/μL,且与其他禽源病毒无交叉反应,批内和批间重复性试验变异系数均不超过2%,具有良好的特异性和重复性。将建立的检测方法应用于检测FAdV4在鸡肝癌细胞(Leghorn male hepatocellular cells,LMH)上的增殖特性,并与TCID50法测定的病毒滴度进行比较,结果显示,2种检测方法具有良好的相关性。综上,本研究建立的检测方法可用于FAdV4的临床早期快速检测。

口蹄疫3D蛋白N端T细胞表位重组蛋白的表达、纯化及鉴定

为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。

基于免疫层析试纸的猪O型FMDV抗体水平监测

为了应用免疫层析试纸评价猪口蹄疫O型合成肽疫苗的免疫效果,对50头试验仔猪进行免疫注射,并在首次免疫后28 d及2次免疫后20 d采血,通过试纸定量测定结果来监测试验猪抗体水平变化,同时对比猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒的检测结果.结果表明,猪口蹄疫O型合成肽疫苗能快速诱导产生高水平的抗体,首次免疫抗体阳性率达88%,2次免疫抗体阳性率高达100%.试纸定量测定结果表明,2次免疫后猪群免疫抗体水平整体显著提升,并保持在较高水平.与ELISA试剂盒比较二者具有相同的敏感性和特异性,符合率为100%.

鹅星状病毒刺突蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为了制备鹅星状病毒(goose astrovirus, GAstV)刺突(Spike)蛋白的单克隆抗体,并对获得的单克隆抗体的生物学特性进行鉴定,将大肠杆菌表达的截短Spike蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合和单克隆抗体的筛选来获得阳性杂交瘤细胞,并进一步利用免疫印迹和间接免疫荧光技术进行单抗的鉴定;采用ELISA技术进行单克隆抗体亚型、抗体效价的测定;同时根据GAstV XX株Spike蛋白序列合成重叠的多肽库进行单抗识别的抗原表位鉴定。共获得3株阳性杂交瘤细胞,分别命名为1A5、2B4、12E6;免疫印迹和间接免疫荧光实验显示3株单克隆抗体均与Spike蛋白具有良好的免疫反应,其中2B4、12E6可与GAstV发生反应;亚型鉴定结果显示单抗12E6、2B4为IgG2b亚类,单抗1A5为IgG2a亚类;轻链均为κ链;敏感性结果显示,抗体效价都在1∶51 200以上;抗原表位的鉴定结果表明单抗1A5识别的抗原表位为(EP16)ELRNRLNIADGDYVI,单抗2B4识别的抗原表位为(EP21)AGDSNPGETFQNFKM。本研究成功制备了针对GAstV Spike蛋白的单克隆抗体,并鉴定出2个新的抗原表位,为建立快速、简便的GAstV检测方法奠定了基础。

猪口蹄疫O型合成肽疫苗抗原多肽的串联表达及活性鉴定

为获得含合成肽疫苗抗原多肽的重组表达蛋白,根据猪口蹄疫O型合成肽疫苗中抗原多肽的氨基酸序列,使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成该抗原多肽的双拷贝基因序列,并克隆至表达载体pET32a中,构建原核表达质粒pET32a-P2。将重组质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果显示,在分子量27 kD处有1条明显的蛋白表达条带,且能被O型FMDV阳性血清识别。对表达产物进行可溶性分析,结果显示,表达蛋白几乎全部以可溶形式存在。表达蛋白经Ni-NTA树脂亲和纯化,SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白在27 kD处有单一目的条带,具有较高的纯度。ELISA检测结果显示,纯化的重组蛋白具有较高的活性。结果表明,该抗原多肽的双拷贝串联重复序列在大肠杆菌中得到了可溶性高效表达,为开发诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。

猪SREBP-1c基因表达谱及其对肌内脂肪细胞脂质沉积的影响

为探究固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)基因对猪脂质沉积的作用机制,采集淮南猪不同育肥时期背最长肌和皮下脂肪组织,利用实时荧光定量(RT-qPCR)技术分析其表达变化趋势;在猪原代肌内脂肪细胞中进行SREBP-1c干扰试验,采用RT-qPCR检测SREBP-1c互作基因及脂质沉积相关基因的表达量,并通过油红O染色检测脂质沉积变化。结果显示,随着育肥进展,SREBP-1c在猪背最长肌和皮下脂肪组织的表达量持续极显著(P<0.01)和显著(P<0.05)上调,提示SREBP-1c可能对猪背最长肌脂质沉积的调控作用更强。在猪原代肌内脂肪细胞中干扰SREBP-1c,其互作基因PPARγ、C/EBPα及脂质沉积相关基因FAS、FABP4、CIDEC的表达量均极显著(P<0.01)下调。油红O染色结果显示,SREBP-1c表达量降低,肌内脂肪细胞脂质沉积明显减少。以上结果表明,SREBP-1c可通过调控脂质生成相关基因表达,影响肌内脂肪细胞的脂质沉积。

传染性法氏囊病毒VP2蛋白抗原表位多肽P22的免疫原性及生物学功能鉴定

为鉴定IBDV VP2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22的免疫原性及生物学功能,作者采用固相多肽合成方法合成多肽P22,经纯化后用SMCC法分别与牛血清白蛋白(BSA)和细胞穿膜肽(PNT)进行偶联,得到免疫抗原P22-BSA和检测抗原P22-PNT;用P22-BSA免疫BALB/c小鼠3只,经3次免疫后得到多抗血清3份。应用ELISA检测了抗P22抗体的特异性,并通过抗P22多肽抗体作为特异性抗体检测了P22多肽结合CEF细胞的特性。结果经鉴定3份多抗血清均与P22多肽特异性反应,效价均达到1∶105,且能特异性检测P22多肽与CEF细胞的特异性结合。本试验成功制备了P22免疫原,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22多抗血清,并证明P22多肽与CEF细胞能够特异性结合,为进一步研究多肽疫苗的设计或试纸条的研制及表位单抗的制备提供了新的思路和基础。

禽腺病毒4型ZZ株的分离鉴定及系统进化分析

为深入研究禽腺病毒4型(FAdV-4)河南流行株的基因组特征和分子进化关系,从患有心包积水综合征的病鸡样品中分离了1株FAdV-4(FAdV-4 ZZ),并对分离毒株进行了全基因组序列分析和分子进化分析。结果表明,FAdV-4 ZZ株可在鸡肝癌细胞上稳定传代并产生明显的细胞病变。与无毒力的FAdV-4 ON1株和FAdV-4 KR5株相比,FAdV-4 ZZ株以及国内流行的CH/JSXZ/2015、JSJ13、SDSX1株均存在ORF19、ORF27、ORF30基因缺失。与国内首次分离的JSJ13株相比,FAdV-4 ZZ株的ORF29序列存在33个碱基缺失。FAdV-4 ZZ株的Hexon基因与国内流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列相似性均为100%,与ON1株和KR5株的Hexon基因核苷酸序列相似性分别为98.69%和98.90%。综上,成功分离了FAdV-4 ZZ株,并获得了分离毒株的全基因组序列及其与国内外相关毒株的分子进化关系。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T-A-vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET-Avp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET-A-vp1的E.coli BL21(DE3)菌后,SDS-PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37℃条件下,IPTG终浓度为0.3mmol/L,诱导表达6h后,VP1蛋白的表达量最大。Western-Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。

IBDV VP2蛋白P22表位多肽的原核表达及初步鉴定

为了进一步了解传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白P22多肽抗原表位的功能,根据IBDVVP2蛋白的三维结构,设计合成编码P22多肽的基因序列,通过大肠杆菌密码子优化,并将基因序列P22串联二次合成并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。用IPTG诱导P22基因的表达。表达纯化后的P22多肽经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析及传染性法氏囊病毒快速检测试纸条检测。结果表明,P22表位多肽的分子质量约为16kD,并能被His单抗识别,用试纸条检测纯化的P22多肽,呈阳性反应结果。提示IBDV VP2蛋白P22多肽能与IBDV单抗特异性反应。

口蹄疫抗体免疫层析试纸的临床应用及性能评价

为评价前期研制的猪口蹄疫O型抗体检测试纸的临床应用效果,检测了162头份口蹄疫病毒(FMDV)多肽疫苗免疫猪血清和87头份灭活疫苗免疫猪血清,并与UBI FMDV抗体检测ELISA和美国BioXL FMDV抗体检测ELISA做平行对比试验。结果显示,试纸与2种ELISA方法的符合率分别为95.06%和96.55%。说明该试纸可以用于猪FMDV O型抗体的临床检测,为评价口蹄疫疫苗免疫效果提供了快速、简便的方法。

奶山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性分析

试验分别采用组织块贴壁法和消化分离法对奶山羊胎儿成纤维细胞进行体外培养,通过原代培养、细胞传代、冷冻保存等成功建立了奶山羊胎儿成纤维细胞系,并对该细胞系进行了形态学观察、生长动力学分析、细胞活力测定、核型分析和微生物检测等多种生物学特性分析.结果表明:成纤维细胞原代培养采用贴块培养时所需时间较长,消化培养有较多死细胞;传代细胞生长情况良好,群体倍增时间(PDT)约为40.4h;生长总体趋势呈"S"型;冻存后活力为92.3%,生长状况与冻存前一致;细胞染色体中二倍体(2 n=60)占主体;细菌、真菌和支原体检测结果均为阴性,细胞系的各项指标均达到ATCC细胞系鉴定标准.

科研信息管理系统功能设计研究

加强科研信息管理系统,实现科技项目、科技成果、科技基础条件、科技人力资源等管理业务的自动化、信息化建设,能为科研人员、技术人员提供方便快捷的业务办理、信息查询、资料下载等综合信息服务,对全面展示机构科研实力和科技成果,支撑机构科技创新与发展,引领和支撑行业科技发展具有重要战略意义。

口蹄疫病毒3D蛋白C端Th表位的重组表达及免疫功能鉴定

为获得含有口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)3D蛋白C端多个Th表位的重组表达蛋白,根据口蹄疫3DC端160个氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET28a,构建原核表达质粒pET28a-C160,并将重组质粒转化BL21(DE3),0.5mmol/L IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,在25ku处有一条明显的蛋白表达条带,且重组蛋白能与豚鼠抗O型口蹄疫病毒阳性血清发生特异性反应。对表达产物进行可溶性分析,结果显示,表达蛋白全部以包涵体形式存在,经变复性后获得较高质量浓度的纯化蛋白。可见:用纯化的3DC160蛋白作为Th佐剂与口蹄疫主抗原混合制成疫苗,免疫后能刺激猪体产生较高水平的口蹄疫抗体。

病毒亲和肽的研究方法及进展（英文）

随着病毒亲和肽研究的不断深入,其在药理和医学上的应用也逐渐成为热点。研究极具潜在药用价值的病毒亲和肽并应用于治疗,给治愈某些感染性疾病带来希望。分析筛选高选择性、高灵敏度的病毒亲和肽,能为疾病检测、治疗及其分子机制研究提供有价值的思路和手段。该文就计算机模拟、分子对接和同源建模等生物信息学预测技术,及噬菌体展示技术等分析筛选病毒亲和肽的研究方法加以综述。

新形势下加强农业科研项目经费管理的思考——以河南省农业科学院为例

经费管理是科研项目顺利实施的重要环节,加强科研项目经费管理是完成预期目标、提升农业科研单位创新能力的重要保证。文章以河南省农业科学院为例,阐述了新形势下加强农业科研项目经费管理的创新举措和取得的成效,分析了当前项目经费管理中存在的主要问题,从提高业务素质和能力、完善预算编制、改进管理方式、加快信息化建设等方面提出了加强农业科研项目经费管理的对策,以期为农业科研单位进一步提升经费管理水平提供参考。