用雄性新生仔猪生殖细胞建立干细胞系初探

体外培养雄性新生仔猪生殖细胞,并检测其碱性磷酸酶活性及O ct-4蛋白,探讨用雄性新生仔猪生殖细胞建立干细胞系的可行性及检测方法。结果表明,雄性新生仔猪生殖细胞在BRL细胞饲养层上培养2 d,大部分生殖细胞呈碱性磷酸酶阳性(AP+),而全部呈O ct-4蛋白阴性(O ct-4-);培养1周后,生殖细胞及细胞克隆均为AP-和O ct-4-。雄性新生仔猪生殖细胞体外培养时出现2类细胞克隆,一类体积较小,数量众多,形成1周后又开始分化,仅能传至第2代;另一类细胞克隆的形态与猪原生殖细胞来源的胚胎生殖细胞(EGC)克隆相似,细胞克隆与周围细胞分界明显,而克隆中细胞相互间界限不清,这类细胞克隆易于分化,可以传至第3代;2类细胞克隆均为AP-和O ct-4-。雄性新生仔猪生殖细胞可作为干细胞系的建系材料,AP和O ct-4蛋白均不适宜用来检测体外培养的雄性新生仔猪生殖细胞及其来源的细胞克隆。

水牛PGC和前精原细胞的体外培养

分别对取自50～95日龄水牛胎儿的原生殖细胞和前精原细胞进行体外培养，观察其生物学行为，并检测其碱性磷酸酶（AP）活性和Oct-4蛋白特性，探讨利用这些生殖细胞建立干细胞系的可行性和检测方法。结果表明：水牛原生殖细胞及前精原细胞分别在体外培养时，均能形成细胞克隆；克隆与周围细胞分界明显，但克隆中细胞相互间界限不清；部分克隆有分隔现象，形如多个克隆共同组成一个大克隆；细胞克隆均至少能培养4代以上；原生殖细胞和前精原细胞及其来源的细胞克隆均呈AP阴性和Oct-4蛋白阴性，其中部分克隆表现为AP假阳性。研究结果显示：水牛原生殖细胞和前精原细胞均可用于建立千细胞系；体外培养时，AP活性和Oct-4蛋白不适宜用来检测这些细胞及其来源的细胞克隆。

昆明小鼠胚胎干细胞建系的初步研究

以昆明小鼠(Mus musculus)为材料,利用超数排卵获得小鼠扩展囊胚、孵化囊胚。为了研究小鼠胚胎干细胞(Mouse Embryonic Stem Cells,mESC)分离和传代的影响因素,设计两个实验:(1)不同孕期(3.5 d或4.5 d)的囊胚对胚胎干细胞分离效率的影响;(2)第5代后,不同传代方法(机械法或酶消化法)对mESC传代的影响。结果显示:在3.5 d孕期时,胚胎为扩展囊胚,在4.5 d时为孵化囊胚,扩展囊胚在贴壁率、原代克隆形成率差异不显著,从在继代培养上显著高于孵化囊胚(P<0.05);第5代后用机械法或胰酶消化法传代对mESC的维持没有明显差别,但从克隆的形态上看,酶消化法优于机械法。最后,本研究从扩展囊胚组中成功获得了一株mESC,该mESC碱性磷酸酶染色呈强阳性,经RT-PCR分析显示表达Oct4、Sox2,核型为正常40XY。