Pri-miRNA21/23a重组病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达鉴定

目的:构建Pri-miRNA-21/23A基因的重组病毒载体,并在L-02肝细胞中获得表达。方法:设计并合成Pri-miRNA-21/23a的基因产物,插入含绿色荧光蛋白Zsgreen基因的真核表达载体pCI Mamma Lian中,以重组质粒为模板,设计扩增含Zsgreen基因的Pri-miRNA序列产物,并将其与pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro病毒载体连接,将Pri-miRNA重组病毒载体转染293T细胞后进行病毒包装,病毒上清转染L-02肝细胞后用荧光显微镜及实时荧光定量PCR确认转染效果。结果:荧光定量PCR结果显示重组病毒上清转染L-02肝细胞感染效果良好,经荧光显微镜观察,证实重组病毒载体能在细胞中表达蛋白。结论:构建了Pri-miRNA21/23a重组病毒表达载体并在L-02肝细胞中表达,奠定了miRNA进一步功能研究的基础。

六价铬致16HBE细胞DNA损伤相关恶性转化的研究

目的通过分析六价铬Cr6＋致16HBE细胞DNA损伤相关的恶性转化情况，为进一步研究Cr6＋的毒性作用机制提供新思路。方法以正常人支气管上皮细胞（16HBE）为研究对象，使用梯度浓度Cr6＋（0、0．625、1．25、2．5μmol／L）染毒处理，通过软琼脂克隆和裸鼠成瘤实验鉴定细胞恶性转化模型是否构建成功。同时，使用单细胞凝胶电泳实验检测细胞DNA损伤情况，并进一步利用免疫印迹（Western blot）法检测细胞DNA损伤修复关键蛋白53BP1的表达水平。结果软琼脂克隆与裸鼠成瘤实验结果显示，Cr6＋染毒16HBE细胞15周后，细胞恶性转化成功。1．25和2．5μmol／LCr6＋处理组在软琼脂中的集落形成数明显高于对照组，且差异有统计学意义（P〈0．05）。2．5μmol／LCr6＋处理组细胞可在裸鼠体内成瘤。Cr6＋染毒后会造成细胞不同程度的DNA损伤，且呈剂量效应关系。Western blot结果显示，与对照组比较，0．625μmol／L和1．25μmol／L浓度组53BP1的相对表达没有明显变化，2．5μmol／L浓度组53BP1的相对表达明显低于对照组，且差异有统计学意义（P〈0．01）。结论Cr6＋可能通过抑制53BP1的DNA损伤修复水平导致细胞DNA损伤得不到及时修复进而诱导细胞恶性转化。

三氯乙烯对人正常肝细胞组蛋白质甲基化修饰影响的研究

目的 筛选三氯乙烯（TCE）诱导的人正常肝细胞（L-02细胞）组蛋白异常甲基化修饰,并探讨其在三氯乙烯致肝细胞毒性中的可能作用.方法 以0、8.0 mmol/L的TCE处理L-02细胞24 h,采用酸法提取组蛋白,通过液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）鉴定和定量分析组蛋白差异甲基化修饰水平,以Western blot验证组蛋白H3K79二甲基化（H3K79 me2）及H3K79三甲基化（H3K79 me3）修饰水平,检测相对表达量.使用单细胞凝胶电泳检测细胞的DNA损伤水平.采用Western blot检测p53与H2AX的磷酸化修饰（？H2AX）的相对表达量.结果 TCE处理L-02细胞24 h后,质谱鉴定出28个肽段的36个表达有差异的组蛋白甲基化位点;L-02细胞经0、8.0 mmol/L TCE处理后,组蛋白H3K79 me3的相对表达量分别为1.00±0.06、0.70±0.09（t=15.01,P=0.015）;组蛋白H3K79 me2的相对表达量分别为1.00±0.05、0.74±0.07（t=16.69,P=0.018）;DNA损伤的Olive尾距值分别为1.46±0.28、3.12±0.68（t=15.22,P=0.018）;蛋白p53的相对表达量分别为1.00±0.04、1.24±0.04（t=18.71,P=0.012）;？H2AX的相对表达量分别为1.00±0.03、1.56±0.11（t=8.32,P=0.045）.结论 TCE引起L-02细胞组蛋白中H3K79 me2与H3K79 me3修饰水平发生变化,并且诱导DNA损伤,提示TCE可能通过DNA损伤导致H3K79 me2和H3K79 me3甲基化修饰的变化.

六价铬化合物致肺癌的研究进展

铬酸盐作为化工原料被广泛应用于冷却塔防锈、电镀、印染等行业中，其产生的六价铬化合物大量存在于生产生活环境中，可通过多种途径进入人体，可导致鼻中隔穿孔、皮肤铬溃疡，长期吸入会导致患消化道癌、乳腺癌、淋巴瘤和肺癌的风险增高。研究发现六价铬在体内致癌作用只发生在肺部，鼻腔等特定部位，可诱导肺癌与鼻窦癌的发生。

三氯乙烯致肝细胞毒性中SET启动子区甲基化水平的改变

目的研究三氯乙烯（Trichlorethylene，TCE）致肝细胞毒性中SET基因启动子区甲基化水平的改变。方法培养L—02肝细胞，使用0、1、2、4、8mmol／L浓度的TCE处理24h，提取细胞基因组DNA，进行亚硫酸氢盐修饰，用PCR扩增目标序列，重亚硫酸氢盐测序法（t3sP）分析TCE作用下肝细胞中SET基因启动子区甲基化状态。结果与对照组比较，TCE处理后L-02肝细胞中SET基因启动子区甲基化水平下降，且随着TCE染毒浓度的增加，SET基因启动子区甲基化水平递减。对SET启动子区甲基化差异位点进行分析发现，差异有统计学意义的甲基化位点有73个，已知转录因子结合位点9个。结论TCE致L-02肝细胞毒性中SET基因启动子区甲基化水平下降，影响转录因子的结合，继而使SET蛋白表达升高。