从健康人外周血单个核细胞中分离出高纯度的CD3^-CD56^+CD16^+NK细胞对肝癌细胞的杀伤作用分析

目的观察经IL-2/IL-15/SCF诱导的CD3^-CD56^+CD16^+ NK细胞体外扩增能力、NKG2D表达变化及其对肝癌细胞的杀伤作用。方法应用免疫磁珠分选法(MACS)从健康人外周血单个核细胞中分离出高纯度的CD3^-CD56^+CD16^+ NK细胞。采用细胞计数法、流式细胞术免疫表型分析和CCK-8等方法比较IL-2/IL-15/SCF对NK细胞扩增倍数、NKG2D表达及对HepG2、SMMC-7721肝癌细胞株杀伤活性的影响;同时观察封闭NKG2D受体对CD3^-CD56^+CD16^+ NK细胞杀伤活性的影响。结果 IL-2/IL-15/SCF培养14 d后,CD3^-CD56^+CD16^+ NK细胞扩增倍数、NKG2D表达以及对HepG2和SMMC-7721的杀伤活性显著增强,与对照组、IL-2组和IL-15组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。NKG2D单抗可以下调其对HepG2细胞的杀伤效应,但对SMMC-7721的杀伤无明显影响。结论 IL-2/IL-15/SCF诱导后CD3^-CD56^+CD16^+ NK细胞对肝癌细胞的杀伤活性增强,NKG2D途径是NK细胞杀伤肝癌细胞的重要机制之一。

不同受压时间窗及干预方式对压疮大鼠模型皮肤损伤及缺血再灌注的影响

目的观察不同受压时间窗及干预方式对压疮大鼠模型的皮肤损伤及缺血再灌注的影响。方法 68只SD大鼠随机分为空白组(S组,n=4,不施压)及造模组(n=64);根据是否采取干预措施,将造模组随机分为不处理(a组,n=32,施压后直接处死)及后处理组(b组,n=32,施压后予缺血后处理后再处死)两小组,分别在受压2、4、6、8 h(每个时间点均为n=8)后观察皮肤受压程度、中性粒细胞浸润程度及血清氧自由基的水平。结果 S、a及b三组大鼠的皮肤损伤程度构成差异有统计学意义(P=0.001),以b组轻于a组;在时间窗方面,受压6 h组有2只大鼠表现为重度损伤,8 h有6只重度损伤(37.5%);而受压2 h及4 h均无造成重度损伤,不同时间窗的损伤程度差异有统计学意义(P=0.043);中性粒细胞浸润程度方面,b组Ⅰ级程度(最轻)只数多于a组(n=17vs n=15),Ⅱ级少于a组(n=8 vs n=10),不同干预方式下的浸润程度差异有统计学意义(P=0.002);受压2 h造成的浸润程度最轻,其次为4 h及6 h;8 h最重,不同受压时间所致的中性粒细胞浸润程度有统计学意义(P=0.027)。在缺血再灌注方面,随着干预时间的延长,a及b组均表现血清超氧化物歧化酶含量下降,而丙二醛及一氧化氮上升,总体以2 h及4 h的再灌注损伤程度低于6 h及8 h;组间比较显示b组的超氧化物歧化酶含量显著高于a组,而丙二醛及一氧化氮低于a组(均为P<0.05)。结论缺血后处理能减轻急性压疮缺血再灌注损伤,其保护作用的有效时间窗为骨骼肌缺血6 h以内,4 h次之,2 h内保护效果更佳。缺血后处理能有效改善大鼠骨骼肌缺血再灌注损伤所致的氧自由基的损伤和炎症反应。

炎症诱导骨髓间充质干细胞条件培养基修复急性辐射引起的小肠上皮干细胞损伤

背景:课题组前期发现,炎症预激活的骨髓间充质干细胞条件培养基可促进大鼠小肠急性辐射损伤后的结构和功能修复,该修复作用是否通过调控小肠干细胞得以实现,目前相关研究尚未明确。目的:探究炎症预激活的骨髓间充质干细胞条件培养基对辐射损伤大鼠小肠上皮干细胞的影响,以进一步明确其修复辐射损伤小肠黏膜的机制。方法:(1)分离、培养、鉴定SD幼鼠(中山大学北校区实验中心提供)骨髓间充质干细胞,分别与正常对照和辐射损伤的小肠隐窝细胞株IEC-6在Transwell培养板中共培养24h,预刺激的骨髓间充质干细胞继续单独培养48 h,收集到的上清液分别为正常状态间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(NOR))和辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基(MSC-CM^(IR));(2)将成年SD大鼠(中山大学北校区实验中心提供)随机分为4组:对照组,单纯辐射损伤组,辐射损伤+MSC-CM^(NOR)组,辐射损伤+MSC-CM^(IR)组,每组20只。后3组以14 Gy剂量一次性腹部局部照射制备急性小肠辐射损伤大鼠模型,造模成功后4 h内,单纯辐射损伤组尾静脉注射DMEM-F12培养基,200μL/d,连续注射3 d;辐射损伤+MSC-CM^(NOR)组、辐射损伤+MSC-CM^(IR)组采用胶囊渗透压泵腹腔植入的方式注射MSC-CM^(NOR)和MSC-CM^(IR),胶囊内含2 mL浓缩条件培养基,植入腹腔后以10μL/h的速率匀速释放。于辐射后第1,3,5,7天取小肠组织行免疫组织化学染色、Western blot及qRT-PCR检测。结果与结论:(1)辐射后第3天,位于隐窝基底增殖活跃的Lgr^(5+)小肠上皮干细胞与对照组相比显著减少,几乎难以观察到阳性细胞;而在输注MSC-CM^(IR)后,Lgr^(5+)小肠上皮干细胞与单纯辐射损伤组相比明显增多,MSC-CM^(NOR)组Lgr^(5+)小肠上皮干细胞未见明显增多;(2)辐射损伤后第3天,位于小肠隐窝+4位置相对静止的Bmi1^+小肠上皮干细胞几乎无法观察到;而输注MSC-CM^(IR)后,Bmi1^+小肠上皮干细胞与单纯辐射损伤组相比明显增多,不仅分布在+4细胞位置,还分布在Lgr^(5+)细胞常见的位置,表明Bmi1+细胞在辐射损伤后有可能通过分化为Lgr^(5+)细胞发挥修复效应;(3)Western blot和q RT-PCR进一步验证,MSC-CM^(IR)组的Lgr5表达在同一时间点均明显高于单纯辐射损伤组和MSC-CM^(NOR)组,持续高水平表达后于第7天恢复至正常水平。MSC-CM^(NOR)修复作用较弱,仅在第7天时与单纯辐射损伤组相比差异有显著性意义;(4)结果表明,炎症预激活状态的骨髓间充质干细胞条件培养基具有保护小肠上皮干细胞的作用。

炎症激活骨髓间充质干细胞条件培养基对辐射损伤IEC-6细胞的修复

背景:间充质干细胞条件培养基是干细胞移植理想的替代方案,课题组前期研究表明炎症预激活的间充质干细胞条件培养基能促进辐射损伤小肠组织学结构和功能的修复,改善急性辐射损伤大鼠生存状态,但其潜在的细胞机制未进一步探讨。目的:观察炎症预激活的间充质干细胞条件培养基对辐射损伤小肠上皮细胞增殖、凋亡的影响,探讨预激活间充质干细胞条件培养基修复小肠黏膜的细胞机制。方法:小肠隐窝IEC-6细胞分为对照组、辐射损伤组、辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组和辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(IR))组,后3组以10 Gy X射线一次性照射IEC-6细胞建立体外急性小肠辐射损伤模型,对照组及辐射损伤组加入DMEM-F12培养基,辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组加入正常状态间充质干细胞条件培养基,辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(IR))组加入炎症激活状态间充质干细胞条件培养基。照射后3 d收集细胞行免疫荧光PCNA染色观察增殖改变,行TUNEL凋亡染色及Western blot蛋白免疫印迹法观察凋亡改变。结果与结论:与辐射损伤组相比,辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(IR))组IEC-6细胞PCNA阳性细胞数明显增加(P<0.05),TUNEL阳性细胞数下降(P<0.05),凋亡相关因子Caspases-3蛋白表达明显下降(P<0.05),而辐射损伤+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组的各项指标变化无统计学意义(P>0.05)。上述结果表明,与正常状态的间充质干细胞条件培养基相比,炎症激活的间充质干细胞条件培养基显著促进辐射损伤肠上皮细胞的增殖,并抑制其凋亡,促进辐射损伤小肠上皮修复。

炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基调控急性辐射损伤小肠炎症反应的作用

背景:骨髓间充质干细胞具有强大的免疫调节和抗炎能力。前期实验发现,炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基可促进急性辐射小肠损伤结构和功能的修复,但其对急性辐射小肠损伤炎症反应的作用机制尚未完全明确。目的:探讨炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基对急性辐射小肠损伤炎症反应的影响。方法:随机将80只SD大鼠(中山大学北校区实验中心提供)分为对照组、单纯辐射损伤组、辐射损伤+正常间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CM^(IEC-6(NOR))组)、辐射损伤+辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基治疗组(IR+MSC-CMIEC-6(IR)组),每组20只。使用尾静脉联合腹腔给药,辐射后第1, 3, 5, 7天,取小肠组织行苏木精-伊红染色观察小肠组织学变化,取小肠组织及血清采用ELISA检测炎症因子水平,辐射后第3天取小肠肠系膜淋巴结组织用流式细胞仪检测CD4^+Foxp3^+Treg细胞数量百分比。结果与结论:①与甲单纯辐射损伤组和正常间充质干细胞条件培养基治疗组相比,辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基组小肠上皮绒毛及隐窝结构明显改善;小肠组织中前炎症因子如白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子。水平显著减少,抗炎因子白细胞介素10水平显著升高;血清中前炎因子ActivinA、白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α水平显著减少,抗炎因子白细胞介素10水平显著升高,以辐射后第3天最为明显;小肠肠系膜淋巴结中CD4^+Foxp3^+Treg细胞数量百分比显著升高,差异均有显著性意义;②上述结果表明,辐射炎症预激活间充质干细胞条件培养基能调控前炎因子和抗炎因子的平衡,增加小肠肠系膜淋巴结中CD4^+Foxp3^+Treg细胞数量,抑制急性辐射小肠损伤全身水平及小肠黏膜的炎症反应,促进小肠黏膜损伤的修复。

靖江市用“铁脚板”跑出“安全感”

我省违法违规“小化工”百日专项整治行动开展以来,靖江市立足“保安全就是保民生”工作思路,高标准、严要求开展多轮摸排,借助明察暗访、有奖举报等手段,严肃查处各类违法违规行为,实实在在地用“铁脚板”丈量企业安全发展“最后一米”,为经济社会发展跑出“安全感”。

TNF-α、IL-1β预激活骨髓间充质干细胞条件培养基修复急性辐射小肠黏膜损伤

目的急性辐射小肠损伤(radiation-induced intestinal injury,RIII)是放射性治疗常见的并发症,尤其是盆、腹腔恶性肿瘤病人接受放射性治疗后,发生率高达75%,但目前的治疗方法有限。课题组前期发现炎症预激活骨髓间充质干细胞条件培养基(mesenchymal stem cell conditioned medium,MSC-CM TNF-α+IL-1β)可以下调炎症,保护肠黏膜,但MSC-CM TNF-α+IL-1β能否修复RIII的研究尚少。本实验利用RIII大鼠模型,探讨MSC-CM TNF-α+IL-1β修复RIII的作用。方法构建RIII大鼠模型,给予MSC-CM TNF-α+IL-1β干预,观察小肠黏膜病理改变,检测肠组织及血清中的促炎因子、抗炎因子的蛋白表达水平,分析治疗效果。结果与单纯RIII损伤组和正常的间充质干细胞条件培养基(mesenchymal stem cell conditioned medium,MSC-CM NOR)相比,MSC-CM TNF-α+IL-1β干预后,RIII大鼠腹胀、血便等临床表现改善,RIII受损肠黏膜病理改变明显减轻,血清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-33显著下降(P<0.05),抗炎因子IL-10明显升高(P<0.05)。同样,肠组织也能检测到促炎因子TNF-α、IL-6显著升高(P<0.05),抗炎因子IL-10显著下降(P<0.05)。结论MSC-CM TNF-α+IL-1β具有治疗作用,通过抑制炎症反应,修复RIII受损肠黏膜。