应用B.t.和SBTi基因提高水稻抗虫性的研究

利用基因枪法将单个B .t.基因或与SBTi基因一起导入到两个华南地区优良籼稻品种中 ,获得 2 1个转B .t.单基因的植株系 ,4个转B .t.和SBTi双基因的植株系。对R1代植株的分子杂交和遗传分析表明 ,3个转双基因系中多个拷贝的B .t.和SBTi基因均是整合在植株基因组同一染色体上相同或相近位点。Northernblot证明在R2 代转基因植株中B .t .基因稳定表达。对稻纵卷叶螟的抗性实验表明 ,转B .t .单基因或B .t.和SBTi双基因的转基因植株均较原种对照有更强的抗性 ,而转双基因植株较转单基因植株又有更强的抗性。

海洋生物功能基因组研究

21世纪是海洋的世纪 ,海洋生物功能基因组研究将因此而成为全球生命科学研究的新热点。通过对国内外海洋生物功能基因组研究的发展现状、发展趋势和该领域的研究方向的综述 ,阐明了开展中国海洋生物功能基因组研究的必要性。

平颏海蛇CRVP基因全长cDNA片段的克隆和序列分析

通过对平颏海蛇毒腺ｃＤＮＡ文库的随机恻序和 ＰＣＲ筛选，克隆得到两种分别长为 １３０９和 １３０７ｂｐ的编码半胱氨酸丰富毒蛋白（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｖｅｎｏｍ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＶＰ）的全长 ｃＤＮＡ序列．这两种ｃｒｖｐ基因同源性为９７％，分别编码２３８和１９９个氢基酸残基，其中包括一段相同的由１９个氨基酸残基组成的信号肽．氨基酸序列分析表明，这两种ＣＲＶＰ蛋白与蜥蜴ｈｅｌｏｔｈｅｒｍｉｎｅ毒素蛋白以及台湾饭铲情ＣＲＶＰ毒蛋白高度同源，而且具有半胱氨酸丰富分泌蛋白（ｃｙｓｔｅｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＣＲＩＳＰ）家族的典型结构特征．

用于转基因植株检测的DNA快速微量提取方法

建立了一个用于转基因小苗检测的ＤＮＡ快速微量方法．每２０ｍｇ新鲜叶片可提出约１０ μｇ ＤＮＡ，且 ＤＮＡ有较好的完整性，Ａ２６０／２８０值在１．７～１．９范围内，并适合于点杂文和ＰＣＲ分析．

转多个抗真菌蛋白基因水稻植株的获得及其抗稻瘟病菌的初步研究

用基因枪法将水稻碱性几丁质酶（ＲＣ２４）基因、苜蓿葡聚糖酶（βＧｌｕ）基因、大麦核糖体失活蛋白（ＢＲＩＰ）基因和潮霉素（ｈｐｔ）基因同时导入籼稻品种（七丝软占）中，获得了７个潮霉素抗性再生系，Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证明２～３个抗真菌蛋白基因已整合到水稻基因组中．

基因枪法转化籼稻胚性愈伤组织获得可育的转基因植株

以籼稻胚性愈伤组织作为基因枪法转化的靶材料，建立了可重复的、高效的籼稻转化系统。从籼稻成熟胚诱寻生长3～4周的愈伤组织，经过2～6周继代培养后，可以形成足够量的颗粒状胚性意伤组织。用含有bar基因B.t.δ-内毒素基因的质粒pFWZ16轰击转化胚性愈伤组织，在含2～4mg／LBasta的培养基上进行筛选、预再生、再生及长根培养，并通过干燥处理增加再生频率和出苗数。从接种到获得转化小植株只需要4～5个月。供试的两个品种为华南地区推广的优良籼稻品种，共轰击821块胚性愈伤组织，获得48个系的477株Basta抗性植株。经PCR扩增分析和Southernblot杂交分析证实外源的bar基因和B.t.基因己整合到转基因水稻植株基因组中，Basta抗性鉴定和PNA点杂交分析表明这两个基因在转基因植株中得到表达。87.5％的转基因植株可育。Basta喷施实验和Southernblot分析证明bar基因和B.t.基因已遗传至子代，并且主要按孟德尔规律进行分离。

使用双抗真菌蛋白基因提高水稻抗病性的研究

将含有串联的RC24基因和β-1，3－Glu基因的pGB12质粒与含有hpt基因的p35H质粒用基因枪法同时导入华南地区一优良籼稻（OryzasativaL．ssp．indica）品种“七丝软占”中。Southernblot分析证明获得17个同时整合有RC24基因和β-1，3－Glu基因的转基因系。而Northernblot分析表明在不同的转基因系中两基因的表达量存在很大差异。对R1及R2代转基因植株的分子分析表明，这两个基因已稳定遗传到R1、R2代，并在RNA水平上持续表达。转基因植株苗期抗稻瘟病试验表明，部分R1代转基因植株苗对广东省稻瘟病菌（Magnaphorthagrisea）中的5个代表菌株表现出不同程度的抗性提高。而其中18株抗性提高的R1代转基因植株的R2代各苗对广东省稻瘟病菌优势生理小种中的3个代表菌株表现出一致的抗性提高，结合分子分析，初步证明获得10株整合有RC24和β-1，3－Glu双基因的稻瘟病抗性提高的R1代转基因纯系植株。且这些转基因纯系植株的离体叶片对纹枯病菌（RhizoctoniaSolaniKuhn的抗性也明显提高。

赤魟尾刺cDNA表达文库的构建

目的 以赤尾刺为出发材料 ,构建以真核表达载体pcDNA 3 0为基础的赤尾刺cDNA表达文库。方法 应用SMARTTMcDNALibraryConstruction技术和初步生物信息学分析等方法。结果 通过对亚文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析 ,已获得了 5 6个赤新EST序列 ,其中已确定的全长cDNA克隆有 2 4个 ,包括IPL肿瘤抑制因子、亲环素cyclophilinA、硒蛋白selenoproteinW、半胱氨酸蛋白酶抑制剂cystatinA、tyrosyl tRNAsynthetase和calcineurin类似物蛋白等。结论 这些基因在赤中绝大多数均为首次发现。赤尾刺cDNA表达文库的成功构建 。

中国蛋白、肽类毒素海洋动物名录及其分布

就中国海域的蛋白、肽类毒素动物进行调查、资料整理。初步发现 ,中国海域的蛋白、肽类毒素动物 ,腔肠动物主要包括水母 13种、海蜇 15种、珊瑚 1种和水螅 2种共 32种 ;软体动物主要包括芋螺 34种、海兔 2种和头足类 3种共 39种 ;纽形动物 1种 ;棘皮动物主要包括海星 2种和海胆 8种共 10种 ;鱼类主要包括毒腺鱼类 1种、鱼皮毒素鱼类 2种和刺毒鱼类种 74种共 77种 ;海蛇 15种。这些蛋白、肽类毒素动物主要分布于中国南海。

玫瑰红绿海葵触手cDNA表达文库的构建和初步分析

A cDNA expression library of the tentacles of Sagartia rosea was constructed. The cDNA was cloned into eukaryotical expression plasmid pcDNA3. SMART TM protocol was used for cDNA library construction and bioinformatics analysis was carried out. 71 novel EST clones were obtained from 130 sequences in the library, of which there were 21 full-length clones, including cytolysin genes, flourescent protein, ubiquinol-cytochrome C reductase gene, elongation factor, ferritin gene riboflavin kinase gene, ribosomal protein. This provides a base for further investigating their biological activity and application.

金钱鱼毒腺cDNA表达文库的构建及EST序列分析

以金钱鱼 (Scatophagusargus)毒腺为出发材料 ,构建以真核表达载体pcDNA3 0为基础的金钱鱼毒腺cDNA表达文库 .应用SMARTTM cDNALibraryConstruction技术和生物信息学分析等方法 ,通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析 ,获得了 2 0 1个金钱鱼新表达序列标签 (ESTs) ,其中已确定全长cDNA的克隆有 2 7个 ,包括多个核糖体大小亚基蛋白 (ribosomalprotein)、细胞凋亡相关蛋白 (programmedcelldeath 10 ) ,G蛋白信号调控子 (Gproteinsignalingregulator)、胸腺素(thymosinbeta 4 )、延伸因子 (translationelongationfactor 1 alpha)和泛素 (ubiquitin)等 .金钱鱼毒腺cDNA表达文库的成功构建 ,为研究金钱鱼毒腺的活性组分及其作用机制奠定了基础 。

平颏海蛇毒腺cDNA表达文库的构建

以真核表达载体质粒pcDNA3为载体 ,成功构建了一个高质量的平颏海蛇毒腺cDNA表达文库 ,这是国内首个海蛇cDNA文库 .通过对亚文库克隆的大规模序列测定和分析 ,发现了 38个海蛇新基因序列 ,其中包括神经毒素基因、磷酸脂酶A2 基因和半胱氨酸丰富毒蛋白基因共 10个编码海蛇毒素蛋白的新基因 .

用基因枪法转化水稻获得转基因植株

从水稻成熟胚诱导的愈伤组织经继代培养后可以产生大量胚性愈伤组织．将分别含有苏云金杆菌δ－内毒素基因［ＣｒｙⅠＡ（ｂ）］、潮霉素磷酸转移酶基因（ｈｐｔ）的质粒混合包裹在金粉上轰击上述胚性愈伤组织．经过筛选和再生培养，得到９２个系的潮霉素抗性再生植株．点杂交结果表明９７．８％的抗性植株含有ｈｐｔ基因，７３．９％的植株同时含有ＣｒｙⅠＡ（ｂ）基因和ｈｐｔ基因．Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交分析进一步证实外源ＣｒｙⅠＡ（ｂ）基因已经整合到水稻基因组中．

用高效的基因枪转化系统将抗虫抗病基因导入水稻

从水稻成熟胚诱导的愈伤组织，经１～３次继代培养后，形成分散颗粒状的胚性愈伤组织，可作为基因枪法转化的靶材料。以ｈｐｔ基因或ｂａｒ基因作为筛选的标志基因，将抗虫或抗病基因共转化至水稻中，在含３０～５０ｍｇ／Ｌ潮霉素或２～４ｍｇ／ＬＢａｓｔａ的培养基上进行筛选、预再生、再生及长根培养后得到转化植株。粳稻台北３０９的转化频率通常超过２０％，最高达到４７６％。籼稻品种的转化频率一般在４％以上，最高为２５５％。分子检测结果表明，抗虫、抗病基因已整合到转基因水稻基因组中，与标志基因的共转化率为５２５％～１００％。

日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库的构建和初步分析

以海洋生物日本鬼鲉毒腺为材料 ,应用SMARTTM cDNALibraryConstruction技术 ,构建以真核表达载体pcDNA3 0为基础的日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库 .通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析 ,获得 94个日本鬼鲉毒腺新表达序列标签 (ESTs) ,其中已确定全长cDNA的克隆有 35个 ,包括溶细胞素基因、类短链神经毒素蛋白、C型凝集素、巨噬细胞迁移抑制因子、致病相关基因等 ,这些基因在日本鬼鲉中绝大多数为首次发现 .日本鬼鲉毒腺cDNA表达文库的成功构建 ,为深入研究日本鬼鲉毒腺的组分及其分子作用机理奠定了基础 .

海葵神经毒素基因的克隆和序列分析

根据已发现的海葵神经毒素蛋白的两端保守氨基酸序列 ,设计简并引物 .用RT PCR方法 ,从侧花海葵 (Anthopleurasp .)触手总RNA中分离出多个神经毒素新基因 .它们分别编码 3个长度都是 4 7个氨基酸的毒素蛋白 ,它们的氨基酸序列与海葵神经毒素C(Ap C)最为相似 .新基因的发现为进一步研究其生物活性及应用打下了基础 .

高效的水稻基因枪转化和可育转基因植株再生

从水稻品种台北309成熟胚诱导生长3～4周的愈伤组织,经过1～3次继代培养后,可以形成大量颗粒状胚性愈伤组织,适用于基因枪转化实验.将分别含有雪花莲凝集素(GNA)基因、hpt基因的质粒pIP860和p35H混合包裹在金粉上轰击转化上述胚性愈伤组织,在含30～50mg/L潮霉素的培养基上进行筛选、预再生、再生及长根培养.使用干燥处理来增加再生频率和出苗数,并摸索出移栽再生小植株的有效方法.从接种到获得转化小植株只需要13～21周.三次转化实验共轰击536块胚性愈伤组织,获得199个系的2783株潮霉素抗性植株.DNA点杂交检测表明73.4%的抗性植株同时含有GNA基因和hpt基因,Southern杂交分析进一步证实了GNA基因在转基因水稻基因组中的整合.89.3%的转基因植株可育.分子证据表明GNA基因和hpt基因已遗传至子代,并且主要按孟德尔规律进行分离.

平颏海蛇碱性磷脂酶A_2的融合表达、纯化及活性特征

将编码平颏海蛇碱性磷脂酶A2 的基因 (PLA2 9)克隆于硫氧还蛋白基因融合表达载体pPETTRX的trxA基因的 3′末端 ,构建符合读码框的融合基因 .2 5℃下经IPTG诱导 ,该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达 ,表达量达 2 0 %以上 .利用金属螯合亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化 ,得到纯度 85%的融合蛋白 .经肠激酶切割和离子交换柱层析进一步纯化后 ,得到浓度 95%以上的成熟PLA2 9.对重组PLA2 9进行了Western印迹检测 .重组PLA2 9具有与天然PLA2 相近的酶活性 ;并具有对HL60等几种肿瘤细胞的细胞毒作用 ,这在海蛇PLA2 中是首次报道 .平颏海蛇碱性PLA2 融合表达及快速纯化系统的建立 。

华支睾吸虫cDNA文库的构建

目的 构建华支睾吸虫cDNA文库。方法 采集华支睾吸虫阳性鱼 ,分离囊蚴 ,感染实验动物兔 ,解剖兔收集华支睾吸虫成虫虫体。应用“一步法”提取华支睾吸虫总RNA ;经过mRNA纯化、cDNA合成 ,以PcDNA3(Amp +)质粒为载体构建文库。挑取 2 0个克隆进行扩增 ,选择 9个克隆进行DNA序列测定。序列结果与GenBank中相关基因进行比对。结果 获得含有 9 7× 10 5个重组子库容量的华支睾吸虫cDNA文库。其中PC6号克隆基因序列与华支睾吸虫半胱氨酸蛋白酶序列具有 93%的同源性。结论 已构建成华支睾吸虫cDNA文库。

基因枪转化籼稻的影响因素

将含有ｇｕｓＡ基因的质粒ｐＡｃｔ１－Ｄ包裹在钨粉上轰击籼稻初生愈伤组织，通过检测ｇｕｓＡ基因在籼稻细胞中的瞬间表达情况，对影响基因枪法转化效率的因素进行了研究．这些因素包括微粒加速装置参数、微粒参数、生物参数及其它参数．实验表明，在合适的转化条件下，籼稻品种青风占１２、穗优占的最高转化效率分别为４３９。