基于叶绿素合成关键基因构建马蹄莲佛焰苞离体VIGS技术体系

返青是天南星科观赏植物在发育过程中发生的一种典型的功能叶绿体重新分化形成的生理现象,其中马蹄莲佛焰苞常出现这一现象,但其潜在的调控机制并不明确。为了探究马蹄莲返青的调控机制,提高彩色马蹄莲的观赏品质,本研究以黄色品种Florex Gold为材料,以返青过程中两个叶绿素合成关键基因ZhGluTR和ZhChlH为研究对象,建立病毒诱导的基因沉默(VIGS)体系,对马蹄莲进行基因功能验证。通过离体佛焰苞孔片试验并对取样部位和侵染时长进行综合分析,结果显示,中部真空抽吸5 min的试验组返青现象出现最迟,VIGS沉默效果最好。在上述沉默背景下,与对照组相比,ZhGluTR和ZhChlH沉默孔片的返青现象均出现得更迟,色调角值上升更缓慢,并且叶绿素含量更低,类胡萝卜素含量更高。综合上述结果表明,本研究建立的VIGS体系可分别有效沉默佛焰苞中的叶绿素合成关键基因ZhGluTR和ZhChlH。研究结果有助于进一步探究马蹄莲佛焰苞返青现象的分子调控机制。

白、青杨派间杂交幼胚培养及杂种子代的分子鉴定

利用切枝水培和组织培养技术,对白杨派的毛新杨和青杨派的不同种源小叶杨进行了派间杂交和杂交子代的幼胚培养研究。结果显示:以不同种源的小叶杨为父本和授粉后幼胚培养的时间对幼胚萌发率影响较大。其中毛新杨×小叶杨(内蒙古通辽)的幼胚培养效果最好,最适培养基为1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L;且随着授粉后天数的增加,幼胚培养的萌发率也相应增加。在此基础上,选用SSR标记技术对杂交子代及其亲本进行了鉴定分析。共采用120对杨树特异的SSR引物对杂交亲本毛新杨和小叶杨进行了多态性筛选,得到了25对在双亲间显示多态性的引物。对其中的两对进行了杂交子代的SSR扩增分析,结果表明,杂交子代均显示出双亲间的杂种类型谱带,可以在分子水平上证明白、青杨派间的杂交可配性。

我国东北及华北地区小叶杨形态及生理性状遗传多样性研究

以东北和华北地区5个种源的小叶杨为材料,分别对17个表型及生理性状进行了比较分析。结果表明:小叶杨各性状在种源间和种源内均存在广泛的遗传变异;平均表型分化系数(VST)为47.11%,种源内变异大于种源间变异;小叶杨群体各性状变异呈梯度变化规律,高海拔的种源表现为苗高、叶大,而低海拔的种源表现则相反;利用种源间欧氏距离进行UPGMA聚类,结果显示,5个小叶杨种源可以划分为3类。研究结果将为天然小叶杨遗传资源的保存和利用提供理论依据。

小叶杨GA20氧化酶基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从小叶杨未成熟木质部cDNA中分离出PsGA20OxcDNA全长及其基因组DNA,并进行测序和序列分析。结果表明:克隆的小叶杨PsGA20OxcDNA片段总长为1403bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1155bp,编码区可编码长度为385个AA残基,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥和水稻GA20Ox蛋白的同源性分别为66.0%和57.0%。组织特异性RT-PCR结果显示,PsGA20Ox基因在杨树茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PsGA20Ox在成熟木质部中表达丰度最高,在未成熟木质部和嫩叶中表达丰度较高,在顶端分生组织中有少量表达,在形成层组织中表达丰度极低。在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对小叶杨36株基因型个体的PsGA20Ox基因组DNA序列进行比对和分析,检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,频率为1/35bp。其中,15个是常见SNPs,34个为罕见SNPs。在这些SNPs中,37个属于转换,12个属于颠换。在外显子区域,共检测到26个SNP位点,其中23个为同义突变,3个为错义突变。对PsGA20Ox基因内SNPs进行的连锁不平衡分析表明,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部就迅速衰退,因此,在小叶杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的。

3个彩色马蹄莲引进品种的核型分析

利用普通压片法对3个引进彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrid)品种的染色体数与核型进行了分析。结果表明:所试验品种染色体数均为2n=32。染色体形态比较一致,多是由中部(m)以及近中部(sm)着丝粒染色体组成。其中,‘Allure’为2n=2x=32=14m(2SAT)+2sm,‘Cupdio’的核型公式为2n=2x=32=14m+2sm,Odessa的核型公式为2x=32=1M+15m(1SAT)。3个品种核型不对称系数分别为56.72%,56.25%和56.38%,核型分类显示其均为1A型。

利用trnL-F序列分析杨属树种的系统发育关系

对杨属4个派17个主要栽培树种及杂种共26个雌雄单株进行了叶绿体trnL-F间隔区序列的PCR扩增、回收和纯化,并分别克隆到pGEM-T载体中进行序列测定。结果表明:在杨树中基因trnL-F间隔区序列的长度为771～811bp,G+C含量为30.6%～31.9%;排序后的比对长度为857个位点,其中46个为变异位点,33个为系统发育的信息位点。以嵩柳和极地柳为外类群,分别用邻接法和UPGMA方法构建了杨属主要栽培树种的系统发育进化树。系统进化分析显示:1)白杨派能聚类形成一个单独分支,而黑杨派亚支与青杨、胡杨派亚支聚类形成另外一个主要的分支,其中胡杨派和青杨派不能区分开;2)青杨派的藏川杨独立于杨属其他种形成一个单独分支,而冬瓜杨却与白杨派聚类在一起;3)白杨派为单系起源,黑杨派和青杨派为多系起源,胡杨派可能也是多系起源。研究结果在分子水平上为杨属树种的起源和系统进化研究提供了证据,具有重要的理论意义和潜在的实践价值。

小叶杨DREB同源基因内SSR的发现及群体结构分析

利用基因特异的PCR引物从小叶杨(Populus simonii)经干旱胁迫后构建的cDNA文库中扩增得到长度为671bp的PsDREB cDNA克隆。该基因内部含有完整的且大小为543bp的开放阅读框,可编码181个氨基酸残基。在此基础上,对36株小叶杨基因型个体的DREB基因进行了克隆和序列分析,发现其内部存在以CAC为基本单位的4次(A)、5次(B)、7次(C)、8次(D)、9次(E)、10次(F)和11次(G)7种类型的简单重复序列(SSR)。以该重复序列为扩增对象设计引物,对我国11个省16个群体528株小叶杨进行了群体遗传结构分析。结果表明,在检测群体中各位点等位基因频率大小顺序依次为:D>C>F>E>A>G>B;平均有效等位基因数为3.1670,平均观察和期望杂合度分别为0.4685和0.5315,且在多数群体中存在一定程度的近交效应和显著偏离Hardy-Weinberg平衡;而Ewens-Watterson中立性检验表明,除山西宁武、辽宁朝阳和河南伊川外,其它多数群体均属于中立性选择。研究结果将为利用候选基因内SSR标记来评价林木育种资源的遗传多样性以及保护和利用这些资源提供科学的理论依据。

彩色马蹄莲大小孢子发生及雌雄配子体发育的研究

2n配子介导的有性多倍化已成为目前我国彩色马蹄莲的主要育种方法,但其进一步应用却受到对彩色马蹄莲生殖生物学特点缺乏了解的严重限制。本研究以"京彩阳光"为材料,利用石蜡切片技术对其大小孢子发生和雌雄配子体发育进行显微观察。结果显示:(1)花药具4囊;花药壁为基本发育型,具变形绒毡层;小孢子母细胞经减数分裂形成左右对称型四分体,胞质分裂为连续型,成熟花粉为二细胞型。(2)胚珠倒生,双珠被,厚珠心;大孢子母细胞经减数分裂形成线性四分体,珠孔端3个大孢子退化,合点端的1个发育成功能大孢子,并经3次有丝分裂形成8核蓼型胚囊。(3)雌蕊先于雄蕊发育且同步性较好;大小孢子及雌雄配子体发育之间以及与花蕾形态之间具有相关性。最后,对该品种的2n雌雄配子诱导有效时期和方法进行了探讨分析,这将为今后探索彩色马蹄莲多倍体育种新方法和新途径提供技术支持和理论依据。

青白杨派间杂交的胚珠培养研究

对由8个白杨派基因型和5个青杨派基因型所组成的13个青白杨派间杂交组合进行胚珠培养试验研究。结果表明:三交要明显好于单交;培养基对胚珠培养影响不大,较合适的培养基为1/2MS+6-BA 1.0 mg.L-1+NAA 1.0 mg.L-1;基因型TB03做母本培养效果优于TB04;随着授粉时间延长,胚珠萌发率也越高。

均匀设计优化杨属的SRAP-PCR反应体系

采用均匀设计方法,对影响杨属SRAP-PCR体系的MgCl2、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶和模板浓度等因素分别进行了U16(45)和U12(35)两轮优化,建立了适用于杨属的SRAP-PCR反应体系。在25μL反应体系中,MgCl23.5mmol/L、dNTPs0.20mmol/L、引物0.44μmol/L、TaqDNA聚合酶1.50U、模板浓度28ng/L为最适条件。在此基础上又对退火温度进行了摸索,结果发现,扩增结果对退火温度变化不敏感。最后运用优化体系对杨属3派10个种共16个单株的DNA进行扩增验证,结果获得的DNA条带清晰,多态性比较丰富。说明这一优化的SRAP-PCR反应体系可用于杨属不同种间亲缘关系、系统进化和遗传多样性等方面的研究。

贮藏温度对彩色马蹄莲块茎糖类代谢与生长的影响

以彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrids)的Black Magic为试材,研究其块茎经不同贮藏温度和时间处理后,块茎碳水化合物代谢及后期植株生长的变化。结果表明,贮藏温度越高,淀粉降解越快;各温度处理总可溶性糖含量与蔗糖含量变化趋势基本一致,9、12、15℃下,贮藏第28天总可溶性糖含量与蔗糖含量达到峰值后明显下降;12℃、15℃贮藏第56天淀粉酶活性达到峰值后明显下降,还原糖含量上升到较高水平,总可溶性糖含量处于较低水平;此阶段块茎萌芽率快速提高,萌芽伸长明显;块茎栽植后株高迅速增高、开花较多。贮藏第56天块茎休眠的打破、萌发与糖类物质变化密切相关。在本试验中,短期贮藏(56 d)以12℃为宜,长期贮藏(112 d)以12℃贮藏56 d再降低至6℃最佳。

利用隶属函数法筛选百合鳞片繁殖最佳条件

以东方系百合索蚌(Sorbonne)和O/T系百合黄天霸(Manissa)2个品种为试验材料,采用室内控温埋片方法,通过对鳞片进行不同激素处理和变温处理,对不同处理下小鳞茎产生的数量、鲜重、直径、根数等指标进行测定。利用隶属函数法对材料的各项指标进行综合评价。结果表明:索蚌鳞片繁殖的最佳条件为:IBA 200mg/L浸泡鳞片30min,置23℃条件下12w;黄天霸鳞片繁殖的最佳条件为:先将鳞片置于23℃条件下8w,然后移置5℃条件下6w。

不同贮藏温度下彩色马蹄莲块茎解除休眠的养分代谢和酶活性变化

以彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrids)品种‘Black Magic'为试材,在6、9、12、1 5℃贮藏0、28、56、84、112 d条件下,研究其块茎的淀粉、可溶性总糖、还原糖含量以及淀粉酶、过氧化物酶(POD)、超氧化歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性变化。结果表明:淀粉含量以及4种酶的活性变化均呈现出随贮藏时间的增加而逐渐下降的趋势;贮藏温度越高,块茎内POD、SOD和CAT酶活性下降越明显;这3种酶活性与块茎萌芽率呈负相关。

玉簪两个变异无性系与原种农艺性状差异分析

试验采用形态观察和描述的方法对玉簪(Hosta)两个变异无性系与相应的原种金冠的13个农艺性状进行差异分析。结果表明,玉簪两个变异无性系株高、芽数、叶脉数、叶片数、全叶长、花朵直径等6个主要形态性状和原种差异显著(P<0.05)。变异无性系1可作为切叶、切花新品种,变异无性系2可作为观赏盆栽新品种。

温室彩色马蹄莲的光合特性研究

以彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrids)4个引进栽培品种为试材,在冬季温室条件下,运用LI-6400XT光合系统测定仪对其光合作用日变化和光响应进行了比较。结果表明,光合作用日变化品种Captain Reno、Tahiti为双峰曲线,Garnet Glow、Florex Gold为单峰曲线;4个品种的光补偿点(LCP)、光饱和点(LSP)、光饱和时光合速率及表观量子效率(AQY)各不相同;Tahiti的LCP和LSP最大为77.0μmol/(m2·s)和1 149μmol/(m2·s);Tahiti光饱和点时最大净光合速率和AQY最小,为7.21μmol/(m2·s)和0.021。

白纹草的组织培养和快速繁殖技术研究

为提高白纹草(Chorophytum bichetii)种苗质量和繁殖效率,以其顶芽或茎段为外植体材料,比较不同实验时间外植体的灭菌效果,筛选诱导丛生芽和继代繁殖的最佳激素配比,建立白纹草离体快繁的技术体系。结果表明,3月取材,外植体的灭菌效果最好,顶芽和嫩茎段的灭菌率分别为74.7%和82.7%;以MS为基本培养基,附加6-BA 2 mg/L+IBA 0.2 mg/L为最佳诱导丛生芽的培养基;以6-BA 2 mg/L+KT 0.2 mg/L为最佳继代增殖培养基,增殖系数达5.1;使用较高浓度6-BA时会发生较严重的玻璃化现象。以1/2MS+NAA 0.1 mg/L为最佳生根培养基,生根率100%;根长0.5 cm左右时最适宜移栽。用泥炭和珍珠岩按2:1混合的基质移栽,移栽成活率达99%以上,并且种苗健壮。在保证繁殖系数前提下尽量降低细胞分裂素浓度,并在继代中不断进行筛选剔除变异株。该技术体系能够满足规模化生产的要求。

彩色马蹄莲切花新品种‘京彩阳光’

马蹄莲新品种‘京彩阳光’是从新西兰引进切花品种‘BlackMagic’中筛选出的变异株系。与原品种相比，其佛焰苞呈亮黄色，花大，长8～9cm，宽7～8cm；花期更早，可提前7～10d；花色、花形及花期等观赏性状整齐稳定，丰产性好，抗逆性强，适宜于北京地区大棚或日光温室栽培。

不同贮藏温度对彩色马蹄莲块茎内源激素变化及萌芽与生长的影响

以彩色马蹄莲(Zantedeschia hybrids)的‘BlackMagic’为试材,研究其块茎经不同贮藏温度和时间处理后,块茎内源激素的变化及对块茎萌芽的影响。结果表明:在不同温度条件下,随贮藏时间的延长,GA3和IAA含量水平均呈上升的趋势,并且贮藏温度越高,GA3含量水平越高。脱落酸ABA含量与GA3呈相反的变化趋势,相同贮藏天数均为15℃处理ABA含量水平最低,6℃处理ABA含量水平最高。随着贮藏时间延长,GA3/ABA、IAA/ABA质量分数比值越大。GA3/ABA、IAA/ABA质量分数比值与块茎萌芽率之间存在一定程度的对应关系。

北京地区百合无症病毒CP基因的克隆与分析

以感染百合无症病毒(LSV)的百合叶片为材料,提取总RNA为模板,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出856bp大小的LSV CP基因片段。经Blast比对发现,该基因片段与Genbank上发表的LSV CP基因序列(DQ294655.1)同源性为97.31%。由该序列推导出的氨基酸序列与其相似度为98.6%,仅存在某些氨基酸的差异。经过聚类分析表明,该CP基因的氨基酸序列与厦门和兰州分离的病毒遗传距离较近,而与海宁和广州分离的病毒遗传距离较远。

O/T百合脱毒技术研究

以感染郁金香碎锦病毒（TBV）和百合无症病毒（LSV）的O／T系百合黄天霸（Manissa）为试验材料，进行了茎尖诱导培养基的筛选；采用不同大小茎尖培养和热处理结合茎尖培养的方式脱除病毒；运用RT—PCR技术进行病毒检测。结果表明，MS±6-BA0．5mg／L＋NAA0．3mg／L培养基比较适宜茎尖不定芽的诱导；（39±1）℃热处理结合0．5-0．7mm大小的茎尖培养脱毒效果最好。