组分百日咳疫苗安全性检测体外替代方法的应用和初步评价

目的:用一种组分百日咳疫苗残留毒性的体外替代检测方法,更稳定和客观地评价疫苗成品的生产一致性。方法:验证直接定性法和间接定量法2种中华仓鼠卵巢细胞簇集试验方法,分别对6个国内外厂家的10种组分百日咳疫苗产品毒性进行定量和定性检测,并使用百日咳毒素参考品将体外法与小鼠组胺致敏试验进行桥接和初步评价。结果:体外定量试验的灵敏度为0.0026±0.0003 IU·mL^(-1),几何变异系数为13%,体外定性试验的灵敏度为0.0067±0.0016 IU·mL^(-1),几何变异系数为24%,组胺致敏试验的灵敏度为3.3 IU·mL^(-1);所有样品的体外定性结果均为阴性,小鼠组胺致敏试验结果均合格,体外定量结果与小鼠组胺致敏结果具有良好的相关性(r=0.737,P<0.05)。结论:本研究在国内首次使用CHO细胞簇集试验方法检测百日咳疫苗成品,并进行了初步评价。该方法灵敏度高于小鼠组胺致敏试验,可应用于百日咳疫苗毒性及毒性逆转检测。该方法需要更广泛的推广应用和数据积累,以达到完全替代动物实验的目标。

不同ELISA系统检测人血清百日咳IgG抗体的比较研究

目的使用A、B、C 3组酶联免疫吸附试验(ELISA)系统进行百日咳疫苗临床血清检测,每组ELISA系统包括至少一种百日咳毒素(PT)、一种丝状血凝素(FHA)和一种黏附素(PRN)包被抗原,其中C组抗原包括2种FHA抗原,酶标二抗是相同的抗人IgG抗体。比较不同包被抗原对百日咳疫苗临床血清中3种IgG抗体检测结果的影响。方法收集164对无细胞百日咳、白喉和破伤风疫苗基础免疫前、免疫后临床血清,使用ELISA法检测和计算血清百日咳IgG抗体的转阳率和单位值。使用χ2检验比较转阳率差异,使用方差分析比较抗体检测结果。结果A组抗原检测IgG抗体结果为PT 82.19IU/mL,FHA 81.66IU/mL,PRN39.34IU/mL;转阳率均为100.0%。B组抗原检测结果为PT 95.59IU/mL,FHA 57.39IU/mL,PRN 40.76IU/mL;转阳率PT抗体为99.4%,其余为100.0%。C组抗原检测结果为PT 60.74IU/mL,2种FHA分别为29.33IU/mL和53.32IU/mL,PRN 34.05IU/mL,转阳率为99.4%、95.1%、100.0%和98.8%。3组抗原检测的临床血清转阳率经χ2检验FHA差异有统计学意义(P<0.05),PT和PRN差异无统计学意义(P>0.05);抗体GMC经方差分析,所有组抗原检测3个抗体值之间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论本次人临床血清抗体转阳率和抗体值达到保护力水平,但是不同抗原检测系统之间差异均有统计学意义,应尽快建立百日咳抗血清IgG检测用抗原试剂国家参考品。

展览温室景观植物的配置——以上海辰山植物园热带花果馆为例

以上海辰山植物园热带花果馆为例,介绍了展览温室的环境,总结了热带花果馆景观植物配置策略以及布展形式,以期为室内景观植物的配置提供参考。

赤泥低钙烧结脱碱硅钙渣制备轻质免烧砖

为实现赤泥的充分利用,以脱碱硅酸钙渣、水泥和砂为原料,采用压实成型技术制备了轻质免烧砖,并利用XRD、FTIR和SEM等方法研究了原料配方和成型压力对免烧砖物理性能的影响。脱碱硅酸钙渣以不规则的蜂窝状颗粒形式存在,主要由硅酸钙水合物和部分CaTiO_(3)、CaCO_(3)和SiO_(2)组成。结果表明,增加硅酸钙渣的含量可以提高免烧砖的抗压强度,降低体积密度,但过量的硅酸钙渣会降低抗压强度和软化系数,增加吸水率。当硅酸钙渣用量在50%~70%时,免烧砖的抗压强度为15.10~24.16 MPa,体积密度为1.3~1.5 g/cm3,软化系数为0.77~0.91,吸水率为28.41%~43.52%。在养护过程中,水化反应产生的水化硅酸钙和水化铝酸钙使原料颗粒絮凝在一起,增强了免烧砖的强度。免烧砖中重金属和钠离子的浸出表明硅酸钙渣轻质免烧砖对环境无害。

百日咳鲍特菌基因组多态性分析

目的了解百日咳鲍特菌(简称百日咳杆菌)基因组特征。方法应用百日咳杆菌等位基因分型法和多位点可变数量串联重复序列分析(MLVA)法分析百日咳杆菌基因多态性,同时对2种分型方法的多态性指数进行统计学分析。结果百日咳黏附素(Prn)、支气管黏附因子(tcfA)和百日咳毒素基因上游启动子区域(ptxP)3种等位基因序列分析结果显示,共发现3种等位基因组合型:Prn1/ptxP1/tcfA2、Prn2/ptxP3/tcfA2和Prn3/ptxP1/tcfA2,所占比例分别为71.43%、19.05%和9.52%。MLVA法将21株分离菌株分成了12个不同的MLVA型,MLVA-136型和MLVA-152型为主要流行MLVA型,所占比例分别为28.57%和19.05%,并发现1种新MLVA型菌株。统计学分析表明MLVA法较等位基因分型法具有更高的分辨率。结论国内部分地区百日咳杆菌流行菌株与欧洲其他国家不同,掌握百日咳杆菌分子流行病学的第一手资料,对有效预防和控制百日咳的流行以及制定新的百日咳疫苗免疫策略具有指导意义。

低抗原含量百日咳疫苗效力评价研究

目的应用改良小鼠脑腔攻击试验(MICA)检测评价低抗原含量百日咳疫苗效力。方法通过中检院和国外实验室平行应用改良小鼠脑腔攻击试验进行不同稀释度相同批次低抗原含量百日咳疫苗的效力,并应用统计软件分析。结果中检院与国外实验室所获得低抗原含量百日咳疫苗的MICA试验效力结果数据均较低(<1.1IU/mL),中检院计算出的效价均在国外实验室分析得出效价的95%可信区间内。结论 MICA方法可应用于低抗原含量百日咳疫苗效力检测分析,该研究为进一步确定中国低抗原含量百日咳疫苗的MICA试验检定标准奠定了基础。

第二代百日咳疫苗毒性国家标准品的建立

目的建立第二代百日咳疫苗毒性国家标准品(简称二代毒性标准品)。方法选用百日咳疫苗生产菌株(编号CS株CMCC58003)进行发酵罐培养,将收获的百日咳菌液灭活后分装冻干后,作为第二代百日咳国家毒性标准品的候选品(简称候选毒性标准品)。以第一代百日咳疫苗毒性国家标准品为标准(简称一代毒性标准品),由4个单位协作标定候选毒性标准品,采用热加速法考察候选毒性标准品的稳定性。结果共获得检定合格的候选毒性标准品1 800支;经4个实验室协作标定,每支二代毒性标准品LPU为21,HSU为41;且稳定性良好。结论候选毒性标准品各项指标均符合要求,可作为第二代百日咳疫苗毒性国家标准品使用。

无细胞百日咳疫苗中百日咳毒素活性测定分析

百日咳毒素(pertussis toxin,PTx)是鲍特氏菌属百日咳杆菌产生的一种主要毒力因子,具有多种生物学活性,如淋巴细胞增多促进活性、组胺致敏活性、中华仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell,CHO)簇集作用、胰岛激活作用、T细胞有丝分裂促进作用、红细胞凝集活性等[1-4],是引起百日咳众多临床症状的原因,同时也是无细胞百日咳疫苗(acellular pertussis vaccine,APV)的主要保护性抗原组分[5]。

SEA为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物初步免疫效果评价

目的对以金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)为载体蛋白的A/C群脑膜炎奈瑟菌结合物的免疫效果进行初步评价。方法采用1-氰基-4-二甲氨基-砒啶四氟硼酸(1-cyano-dimethylamino pyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)活化法,将SEA、破伤风类毒素(tetanus toxin,TT)分别与A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group A N.meningitidis capsular polysaccharide,GAMP)、C群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖(group C N.meningitidis cap-sular polysaccharide,GCMP)结合制备结合物;将结合物分别免疫BALB/c小鼠,腹部皮下免疫3次,于第1针免后第9天、第19天、第27天眼眶采血,分离血清备用;检测体液免疫及细胞免疫反应水平。结果 SEA与GAMP结合后能增强抗-GAMP Ig G抗体水平,第3次免后GAMP-SEA组多糖抗体水平达到1∶12 800,高于GAMP组1∶400,但GCMP-SEA组结果不理想。SEA与GAMP结合后均能激发细胞免疫反应,IFN-γ和IL-4的SFC与GAMP组比较均升高,且IFN-γ高于IL-4。SEA与GAMP、GCMP结合后Th1/Th2细胞亚群比值分别达到23.48和22.19,高于GAMP组(14.09)和GCMP组(16.73),差异有统计学意义(P<0.05),提示SEA与GAMP、GCMP结合后可激发细胞免疫。结论 SEA与GAMP、GCMP结合后既能增强GAMP、GCMP的免疫原性,提高体液免疫反应,又能激发细胞免疫反应,提示SEA具备作为A/C群脑膜炎奈瑟菌结合疫苗载体蛋白的可行性。

富氢水处理对猪笼草扦插生根的影响

探讨不同富氢水浓度对猪笼草生根的影响,为猪笼草生产繁殖作为参考。选取2种猪笼草品种为试验材料,分别采用1%、15%、25%、50%、100%浓度的富氢水与清水作对照进行扦插快繁试验,分析富氢水处理对猪笼草扦插生根率、发芽率、根数、根长及最早生根时间的影响。结果表明:不同浓度的富氢水处理对不同品种的猪笼草扦插影响不同。其中红瓶猪笼草使用15%富氢水处理效果最好,N.sibuyanensis×maximawei使用50%富氢水处理效果最好。富氢水处理可明显缩短猪笼草扦插的时间,提高产能。

首批百日咳杆菌鼠源抗血清国家参考品的制备和标定

目的制备和标定百日咳杆菌鼠源抗血清国家参考品。方法按《中华人民共和国药典》2015版(三部)(简称《中国药典》)相关要求,制备候选百日咳杆菌鼠源抗血清参考品(简称候选参考品),以WHO百日咳杆菌鼠源抗血清标准品(编号97/642)为标准,组织3家单位进行协作标定,并采用热加速试验对候选参考品进行稳定性观察。结果共制备合格候选参考品300支,其外观、水分、分装精度均符合《中国药典》的相关要求;协作标定结果显示,室内和室间几何变异系数(geometric coefficient of variation,GCV)均低于20%;经统计学分析,最终确定候选参考品中含PT-Ig G、FHA-Ig G、PRN-Ig G分别为95 IU/m L、917 IU/m L、102 IU/m L,95%可信区间分别为91.7~103.7 IU/m L、900.2~944.5 IU/m L、99.4~106.1 IU/m L;每支安瓿分别含PT-Ig G 19 IU、FHA-Ig G 183 IU、PRN-Ig G21 IU;候选参考品于-20℃放置15个月及37℃放置7 d、14 d、21 d和28 d后,各种百日咳组分抗体的酶标单位值均变化不大,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论首批百日咳杆菌鼠源抗血清国家参考品均符合《中国药典》的各项要求,且一致性、稳定性良好,可用于百日咳组分疫苗小鼠效力血清学方法的质量控制评价。

肺炎链球菌表面蛋白A的制备与鉴定

目的通过基因合成法获取3种不同分支肺炎链球菌表面蛋白A(Psp A)的目的基因,制备重组蛋白。方法根据Gen Bank中Psp A相应分支菌株的基因序列、氨基酸序列,通过密码子优化合成目的基因,并与表达载体连接且转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中诱导表达。表达产物经不同步骤层析纯化获得目的蛋白,对其进行免疫原性鉴定。结果人工合成3株菌株的Psp A基因序列经鉴定与Gen Bank的基因序列一致。3种蛋白在大肠杆菌中均以可溶形式表达,表达量在30%以上,经多步骤纯化其纯度达到90%。3种蛋白均能与阳性血清产生特异性抗原抗体反应。结论成功制备3种无标签Psp A蛋白,且具备与天然抗原相似的抗原性,为后续研究奠定基础。

肺炎链球菌蛋白PspC的制备与鉴定

目的对肺炎链球菌表面蛋白C(PspC)进行全基因合成、重组表达、纯化制备和鉴定。方法根据Gen Bank中Psp C的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得目的蛋白基因,构建无标签、高效重组表达菌株,建立重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测分析。结果人工合成的Psp C基因序列经鉴定与预期一致,目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量在30%以上,经两步纯化后纯度达到95%。重组蛋白能与肺炎链球菌阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论获得了重组肺炎链球菌蛋白Psp C,其具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为今后开展疫苗研制、载体蛋白应用等研究奠定基础。

液相色谱-串联质谱法测定百日咳和百白破疫苗中百日咳杆菌气管细胞毒素

百日咳杆菌气管细胞毒素(TCT)是一种引起百日咳及百日咳相关疫苗不良反应的毒性糖肽。尽管各国药典均规定了百日咳疫苗产品中TCT的含量限度,但均没有推荐TCT的含量测定方法。该研究发展了一种液相色谱-串联质谱法用于TCT的含量测定。实验优化了包括色谱柱类型和流动相组成在内的TCT色谱条件。虽然TCT在反相色谱模式和亲水作用色谱(HILIC)模式下均具有较好的保留,但HILIC模式与蛋白质沉淀的前处理方法兼容性更好,因此采用HILIC模式分离TCT。优化所得的方法具有较宽的线性范围(5.76～369 ng/L),良好的重复性(峰面积的相对标准偏差不大于3.9%),各种基质中均有较好的回收率(96.4%～102.5%),且定量限是药典要求的TCT最高限量的1/1 279。将本方法用于共纯化百日咳疫苗、组分百日咳疫苗、共纯化无细胞百白破疫苗和组分无细胞百白破疫苗中TCT的检测,所有产品均未检出TCT,表明被检样品具有较好的工艺条件可避免TCT在产品中的残留。

第三代百日咳疫苗毒性国家标准品的制备和标定

目的:制备和标定第三代百日咳疫苗毒性国家标准品,用于百日咳疫苗毒性检测。方法:按照《中国药典》三部(2015版)的相关要求,选用百日咳疫苗生产菌株CS株进行发酵罐培养,将收获的百日咳菌液灭活后分装冻干,作为第三代百日咳疫苗毒性国家标准品的候选品。按照《中国药典》三部要求对候选品进行检定,以第二代百日咳疫苗毒性国家标准品为标准,组织6家单位进行协作标定,并采用热加速试验对候选毒性标准品进行稳定性考察。结果:共制备合格候选毒性标准品7000支,其外观、水分、分装精度均符合《中国药典》的相关要求;协作标定结果经统计学分析,最终确定每支第三代毒性标准品LPU为60,HSU为84;且稳定性良好。结论:候选毒性标准品各项指标均符合《中国药典》的各项要求,且一致性、稳定性良好,可作为第三代百日咳疫苗毒性国家标准品使用。

两种不同类型无细胞百日咳疫苗诱导小鼠免疫应答分析

目的比较两种不同类型无细胞百日咳疫苗免疫小鼠后诱导体液免疫和细胞免疫应答的特点。方法将BALB/c小鼠分为3组(分别纯化Pa组、共纯化Pa组、PBS组),分别用稀释后的两种不同工艺生产的无细胞百日咳疫苗及PBS皮下接种,接种量0.5 m L/只,于第4周加强免疫,剂量与初免相同。于免疫后第1周、第4周和第5周取血,分离血清用于检测小鼠抗百日咳抗体Ig G水平(抗-PT和抗-FHA);同时于加强免疫后第7天,分离小鼠脾淋巴细胞,经刺激后,取其培养上清,用流式细胞微球芯片捕获法(cytometric bead array,CBA法)测定脾淋巴细胞经体外刺激后所产生的Th1、Th2和Th17型细胞因子的含量。结果对两种类型无细胞百日咳疫苗组检测的结果进行比较,在免后第4周,分别纯化Pa组和共纯化Pa组的抗-PT和抗-FHA Ig G水平差异无统计学意义(P>0.05);但在免后第5周,分别纯化Pa组的抗-PT和抗-FHA Ig G水平均高于共纯化Pa组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。经PT刺激后诱导产生的细胞因子,分别纯化Pa组的IL-4含量高于共纯化Pa组,差异具有统计学意义(P<0.05);分别纯化Pa组和共纯化Pa组的其他细胞因子差异均无统计学意义(P>0.05)。结论两种类型的无细胞百日咳疫苗免疫小鼠后均能诱导产生体液免疫应答和细胞免疫应答。

百日咳毒素抗原检测系统的建立及其应用

目的建立吸附无细胞百白破联合疫苗中百日咳毒素(pertussis toxin,PT)的ELISA测定方法,并进行验证及应用。方法以PT作为检测抗原,用高效价鼠单抗和相应的兔多抗建立双抗体夹心ELISA,确定方法的线性范围、重复性、准确性、专属性等,并进行初步应用。结果 PT质量浓度在2.5～80.0 ng/m L时线性良好,决定系数R2>0.98。该方法与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎病毒原液、甲肝疫苗原液、乙肝疫苗原液、白喉类毒素(diphtheria toxoid,DT)、破伤风类毒素(tetanus toxoid,TT)、百日咳丝状血凝素(filamantous hemagglutinin,FHA)、黏着素(pertactin,PRN)均无明显交叉反应,重复性好,专属性较强,其他均符合常规质控要求。该抗原检测系统对生产具有指导意义,并可以正确反映原液及成品中PT的稳定性。结论建立了PT双抗体夹心ELISA检测方法,为吸附无细胞百白破联合疫苗生产过程中PT含量的质量控制提供有效的技术手段。

无细胞百日咳疫苗抗体活性持久性监管研究

目的:比较不同类型无细胞百日咳疫苗免疫小鼠后诱导的抗体应答及其持久性。方法:将来自于3家企业,采用2种不同工艺生产的无细胞百日咳疫苗(组分苗和共纯化苗)按一定比例稀释后分别给3组小鼠皮下接种,0.5 mL/只,于第4周加强免疫,剂量与初免疫相同。于免疫后第4周、第5周、第8周、第12周、第17周、第30周、第40周、第50周和第65周取血,分离血清,检测小鼠血清中抗百日咳抗体IgG水平(抗-PT和抗-FHA)和PT的中和抗体水平,并对其结果进行分析比较。结果:两类疫苗组检测结果比较,在免疫后第30周之前,两组之间抗-PT和抗-FHA水平无显著性差异;但在30周之后,两组之间抗-PT和抗-FHA水平有显著性差异(P <0.05),组分苗组抗体水平高于共纯化苗组。中和抗体方面,组分苗组中和抗体水平高于共纯化苗组,两组比较有显著性差异(P <0.05)。结论:两种类型的百日咳疫苗免疫小鼠后均能诱导产生体液免疫应答,组分苗组的抗体持久性(包括百日咳抗体IgG和百日咳PT中和抗体)强于共纯化苗组;且百日咳IgG抗体与中和抗体之间具有一定的相关性。

吸附百白破联合疫苗实施同步批签发的回顾性研究

为保障一类疫苗的市场供应,于2019年年初开通了疫苗同步批签发通道。目前为止,已有3家企业生产的吸附无细胞百白破联合疫苗产品实施同步批签发。本文主要以百日咳疫苗为例:1)回顾性分析该产品在实施同步批签发以后产品质量的一致性、稳定性;2)中国食品药品检定研究院在抽样检验时的主要考量依据;3)企业关键自检数据与中检院抽检数据的对比。为同步批签发的应用提供数据积累。

浅析旅游局信息化水平与旅游产业信息不对称

2009年12月1日下发的《国务院关于加快发展旅游业的意见》指出,要以信息化为主要途径,提高旅游服务效率。在2010年7月28～29日的全国旅游局长研讨班上,国家旅游局局长邵琪伟认为,推动旅游业转变发展方式的手段中,要"充分运用现代科技特别是信息技术提升旅游业"。