CLIC1及其点突变体与Sedlin蛋白的共定位研究

目的构建胞内氯离子通道蛋白1(CLIC1)点突变体的真核表达质粒,进行CLIC1突变体的表达、定位及其与迟发性脊椎骨骺发育不良病蛋白(Sedlin)的共定位研究,为进一步揭示其功能奠定基础。方法以CLIC1全长c DNA序列为模板,构建3个真核表达质粒即pc DNA3.1-CLIC1(C24A)-FLAG、pc DNA3.1-CLIC1(C59A)-FLAG、pc DNA3.1-CLIC1(C24A-C59A)-FLAG;Western blot法检测CLIC1及其点突变体在HEK 293T细胞中的表达;免疫荧光技术了解CLIC1及其点突变体蛋白在COS7细胞中的定位及与Sedlin的共定位情况。结果成功构建了CLIC1点突变体的真核表达质粒;Western blot结果显示3个点突变体蛋白在HEK293T细胞中均能表达,突变体的分子量低于野生型的;免疫荧光实验表明CLIC1蛋白在细胞质和细胞核都有表达,但主要在细胞核。CLIC1点突变体蛋白定位在胞质中,细胞核中无分布,与Sedlin蛋白在胞质存在共定位。结论CLIC1的3种点突变体均能在哺乳动物细胞中有效表达;CLIC1及其点突变体与Sedlin蛋白均存在共定位,提示两种蛋白之间可能存在相互作用。

高内涵脂滴三维影像定量分析研究细胞内的脂质储存

目的:研究细胞内脂滴含量的变化对肥胖、糖尿病等代谢性疾病发生发展的影响。方法:建立高内涵脂滴三维成像和定量分析系统,获得脂滴三维动态表型参数,例如细胞内脂滴的总体积量、脂滴平均体积、单一细胞内脂滴平均数量等指标。选择HeLa、AML-12、COS-7和3T3-L1四种细胞系进行油酸、基因沉默、酶活性抑制剂的处理,量化处理后四种细胞内的脂滴数量与大小的表型差异。结果:在加入油酸情况下,细胞随油酸浓度增加而生成更多、更大的脂滴,但AML-12细胞只有展现增加脂滴数量的变化表型;在HeLa细胞中进行19种中性脂合成通路上关键基因的转录表达沉默,发现需要同时双敲降两种甘油三酯合成酶DGAT1和DGAT2才能显着降低细胞内脂滴总体积储存量,但在COS-7细胞中只需要单敲降DGAT1即可降低脂滴存量;进一步使用了DGAT1/2抑制剂处理四种细胞后,发现对抑制剂响应可区分为两类细胞分组(HeLa、AML-12与COS-7、3T3-L1)的脂滴存量表型差异,其原因是DGAT1和DGAT2的转录表达谱在这两类细胞分组中的不同。结论:建立了高内涵脂滴三维成像和定量分析系统,量化了四种细胞系的脂滴数量与大小的表型差异,揭示了细胞的脂滴脂储存方式与蛋白酶表达谱的关系。