人Endostatin cDNA的克隆及其在HT1080细胞中的表达

目的 :构建能表达人Endostatin的真核表达质粒。方法 :设计引物从成人肝cDNA文库中通过PCR扩增到EndostatincDNA ,并在 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ,经测序证实后连接到真核表达载体pcDNA3.1(- )中。将携带基因的真核表达载体质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后用G4 18筛选获得克隆 ,采用RT PCR和West ern blot检测Endostatin的表达。结果 :测序结果表明克隆的人EndostatincDNA完全正确 ,并且在其 5′端融合编码人胰岛素信号肽序列 ;RT PCR显示转染后的HT10 80细胞可以有效地转录EndostatinmRNA ;Western blot检测到转染后的HT10 80细胞上清有相应的蛋白质 ,大小为 2 0kD左右。结论 :含有人胰岛素信号肽序列的人EndostatincDNA重组质粒pcDNA3.1(- ) SEND转染HT10 80细胞后可以有效的表达目的蛋白并能分泌到细胞外 。

VEGF_(121)在哺乳动物细胞中的稳定表达

目的探讨pcDNA3.1-VEGF121质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法将pcDNA3.1-VEGF121质粒用电转的方法导入CHO细胞中,G418筛选细胞克隆;通过RT-PCR,ELISA,Western-blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF121在转基因CHO细胞中的表达;通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF121的生物学活性。结果获得有G418抗性的CHO细胞克隆;RT-PCR扩增出一条大小约450bp的特异性泳带,测序结果与VEGF121mRNA一致;ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为8～22ng/ml;Western-Blot检测到大小为17KD的特异性蛋白质条带;内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用;血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性。结论pcDNA3.1-VEGF121质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF121蛋白。

金针菇担孢子原生质体制备条件的研究

为了得到更利于细胞融合的原生质体 ,研究了几个影响金针菇担孢子原生质体制备的最重要因子 ,当用 0 .6mol/L Mg SO4 .7H2 O作渗透压稳定剂 ,在 35℃、2 %溶壁酶中酶解2 .5h后 ,可获得纯净且量多的原生质体 ,其产量最高达 6× 1 0 7个 /m L,原生质体大小比较均一 ,直径约 8.2

鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤临床分期与人乳头状瘤病毒感染的关系

目的探讨人乳头状瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)与鼻腔鼻窦内翻性乳头状瘤(Nasal InvertedPapilloma,NIP)病变范围的关系。方法取99例NIP石蜡包埋组织标本采用核酸分子快速导流杂交基因芯片分型技术(HybriMax)对21种HPV亚型同步进行检测和病毒分型,并以24例健康志愿者鼻腔黏膜组织为对照。结果 NIP石蜡标本HPV总感染率64.65%(64/99),对照组均为阴性(0/24)。NIP组、对照组比较有统计学意义(P<0.05)。NIP不同临床分期间的HPV感染率差异有统计学意义(P<0.05)。结论 NIP的发病与HPV感染密切相关,HPV感染能使NIP病变范围扩大,明确NIP中HPV亚型的感染情况,对肿瘤临床行为的预测和指导临床手术有一定意义。

VEGF_(165)在哺乳动物细胞中的稳定表达

目的 探讨pcDNA3 1-VEGF1 65质粒对哺乳动物细胞的表达和转染。方法 将pcDNA3 1-VEGF1 65质粒用电转的方法导入CHO细胞中 ,G418筛选细胞克隆。通过RT -PCR、ELISA、Westen -blot在转录水平和蛋白质水平上检测VEGF1 65在转基因CHO细胞中的表达。通过内皮细胞增殖实验和血管通透性实验检测所表达的VEGF1 65的生物学活性。结果 获得有G418抗性的CHO细胞克隆。RT -PCR扩增出一条大小约 60 0bp的特异性泳带 ,测序结果与VEGF1 65mRNA一致。ELISA显示细胞培养上清的VEGF浓度约为 10～ 2 0ng/ml。WESTEN -BLOT检测到大小为 2 3KD的特异性蛋白质条带。内皮细胞增殖实验显示细胞培养上清具有促内皮细胞增殖作用。血管通透性实验显示细胞培养上清明显增加毛细血管通透性。结论 pcDNA3 1-VEGF1 65质粒真核表达系统能在哺乳动物细胞中表达具有良好生物学活性的VEGF1

上海地区HPV分型及高危型HPV负荷量与宫颈病变的关系

目前发现已鉴定出的100多种HPV亚型在不同国家与地区的流行病学分布不同,而HPV负荷量的高低与宫颈病变的严重程度存在相关性.为了探讨上海地区HPV亚型的分布特征及高危型HPV负荷量与宫颈病变的关系,收集了就诊于上海市浦东新区公利医院宫颈疾病门诊患者515例,采用导流杂交基因芯片技术(HybriMax)对HPV进行基因诊断和分型;并使用实时荧光定量PCR方法检测HPV负荷量,统计分析负荷量与宫颈病变程度的相关性.结果表明,上海地区共检测出18种HPV亚型,检出率大于5%的HPV亚型(HPV-16,58,33,52,31,18)均属于高危型;4种高危型HPV(16,58,33,52)与宫颈病变严重程度呈显著相关;Spearman等级相关分析显示,HPV负荷量与宫颈病变级别呈正相关(r=0.318,P=0.000);两种高危亚型HPV-16和HPV-33的负荷量为这种正相关性的主导因素.本研究确定了上海地区HPV流行的主要亚型及HPV负荷量与宫颈病变程度的关系,这为开发预防中国人群(特别是上海地区)常见HPV亚型的多价疫苗提供了有效证据,为高HPV负荷量作为高级别宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌筛查的有意义指标提供了佐证.