Ⅴ型分泌系统菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素及其受体结合位点的确定

自主转运蛋白(V型分泌系统)的β结构域已被证明可以将异源性多肽展示在细菌表面。运用DNA重组技术优化构建V型分泌系统MisL并在菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素FedF及其受体结合域FedF1。含重组质粒pnirBMisL-fedF或pnirBMisL-fedF1大肠杆菌(E.coli)DH5α经厌氧诱导后,分别与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子血清和F18大肠杆菌黏附素受体易感性仔猪的小肠上皮细胞做玻板凝集试验和体外黏附试验,结果表明上述两株诱导表达重组菌与FedF抗血清发生明显的凝集反应,且能较好地黏附于F18大肠杆菌黏附素受体易感性仔猪小肠上皮细胞。而菌体表面展示F18大肠杆菌黏附素FedF突变体FedF(M)(黏附素受体结合域第88和89位组氨酸残基双突变为丙氨酸)的重组菌则失去上述凝集和黏附特性。以上试验结果说明,F18大肠杆菌黏附素FedF及其受体结合域FedF1在大肠杆菌表面得到了功能性表达,并进一步证明了位于FedF受体结合域内第88和89位组氨酸残基对FedF受体结合域的形成至关重要。

大肠杆菌同源重组工程研究进展

传统的以限制性内切酶和连接酶为基础的DNA重组技术曾经革命性地推动了分子生物学和遗传工程的发展,至今仍然发挥着重要作用.……

细菌Ⅴ型分泌系统研究进展

目前已知革兰阴性(G-)细菌的分泌系统至少有5种类型,即Ⅰ～Ⅴ型。其中Ⅴ型分泌系统为G-菌外膜通道转运蛋白系统中最大的一个家族,该系统又称自主转运蛋白系统,它首先通过Sec依赖的分泌通路跨内膜转运,到达外周质间隙后,又通过自身的C端在外膜上形成一个β折叠桶实现跨外膜转运。Ⅴ型分泌系统的分泌装置最为单一,且该系统分泌的蛋白在跨外膜转运过程中似乎不需要能量和辅助因子(蛋白)的参与。随着对运用Ⅴ型分泌系统在G-菌表面展示异源性多肽/蛋白质的深入研究,该系统在生物技术领域已展示出巨大的应用前景。

苏太仔猪FUT1基因M307位点多态性与F18大肠杆菌抗病相关性的体外鉴定

采用PCR-RFLP方法检测了江苏苏太断奶仔猪FUT1基因M307位点等位基因多态性分布,在所检的49头仔猪中,GG基因型个体16头,AG基因型19头,AA基因型14头。在此基础上,制备上述不同基因型个体仔猪小肠上皮细胞,分别与表达F18ab菌毛的野生型大肠杆菌、表达F18ac菌毛含fed操纵子全基因的重组大肠杆菌和V型系统表面分泌表达F18abFedF亚单位的重组大肠杆菌进行体外黏附试验和黏附抑制试验。研究结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述3种大肠杆菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。将上述3种大肠杆菌分别与抗F18ab菌毛高免血清、F18ac菌毛高免血清及抗F18abFedF亚单位单因子血清作用后,则失去黏附仔猪肠上皮细胞能力。上述结果对苏太猪从体外试验上证明了FUT1基因M307位点多态性与断奶仔猪腹泻和水肿病存在着直接的相关性。

致病性F18大肠杆菌黏附素受体易感性仔猪的体外鉴定

在PCR-RFLP方法分析了不同猪个体FUT1基因M307位点等位基因多态性的基础上，制备M307位点为GG和AG2种类型仔猪小肠上皮细胞分别与表达F18ab菌毛的野生型大肠杆菌、表达F18ac菌毛含fed操纵子全基因的重组大肠杆菌及表面分泌表达F18ab菌毛FedF亚单位的重组大肠杆菌进行体外黏附和黏附抑制试验。结果表明，上述野生菌或重组菌对GG和AG2种基因型的30～35日龄断奶仔猪小肠上皮细胞均具有较好的黏附能力。上述3种大肠杆菌分别与抗F18ab纯菌毛血清、F18ac纯菌毛血清及抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子血清作用后．则丢失黏附小肠上皮细胞能力。而GG基因型的3日龄仔猪小肠上皮细胞不能很好的黏附上述野生菌或重组菌．但是可以很好地黏附表达987P菌毛的大肠杆菌。

禽致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛fimH基因缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

基于禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因的已知序列,利用λ噬菌体的Red重组系统构建禽致病性大肠杆菌国内分离株A2(血清型02:K89)Ⅰ型菌毛黏附素.fimH基因缺失突变株A2△fimH∷Cat,在二次重组中利用携带能够表达FLP位点特异性重组酶的质粒pCP20(温度敏感性)以去除上述缺失突变株中抗性基因标志,结合PCR扩增和测序结果,证明.fimH基因缺失株A2ΔfimH的正确构建。通过fimH基因互补试验使A2ΔfimH缺失突变株恢复了与野生株具有相同的凝集活性。红细胞和酵母细胞凝集试验结果表明,野生株呈现良好的凝集效果,并能被0.5%甘露糖完全抑制,而A2△fimH缺失突变株未呈现任何凝集现象。体外生长试验结果表明,在同样的培养条件下,A2△fimH缺失突变株生长周期的各个阶段都要稍慢于野生株。禽致病性大肠杆菌国内分离株Ⅰ型菌毛黏附素fimH基因缺失突变株成功构建,为进一步深入研究禽大肠杆菌Ⅰ型菌毛与机体相互作用的分子机制,肠道外感染的致病机理及对国内禽大肠杆菌病的防控策略奠定了一定基础。

F18大肠杆菌黏附素受体结合域鉴定新方法

运用DNA重组技术将F18ab和F18ac大肠杆菌黏附素fedF亚单位内的第60～109位氨基酸残基区段(fedF1)和fedF全基因克隆入V型分泌系统MisL的载客结构域上,经DNA测序确证其正确阅读框后,含重组菌质粒pnirBMisL-fedF或pnirBMisL-fedF1经厌氧诱导后,与断奶仔猪小肠上皮细胞进行体外黏附试验。结果表明:FUT1基因M307位点中GG型和AG型仔猪小肠上皮细胞均能黏附上述重组菌,而AA型个体小肠上皮细胞则不能黏附。上述重组菌均能与兔抗F18ab菌毛FedF亚单位单因子高免血清发生玻板凝集反应。而FedF突变体FedF(M)的重组质粒菌则失去上述凝集和黏附特性。证明F18大肠杆菌黏附素fedF基因及其基因片段fedF1在大肠杆菌表面得到了功能性表达,F18ab和F18ac黏附素FedF直接介导F18大肠杆菌与易感仔猪小肠上皮细胞表面大分子受体黏附结合,fedF1为黏附素FedF的受体主要结合域,其His88、His99是FedF黏附素受体结合域的重要氨基酸残基。

猪α1岩藻糖转移酶基因点突变的PCR-SSCP检测

猪α1岩藻糖转移酶基因(FUT 1)位于猪第6号染色体上,是猪肠毒素大肠杆菌F 18受体(ETEC F 18R)理想的候选基因。采用PCR-SSCP法共检测外来猪种、国内地方猪种和培育猪种3个类型9个猪种共计255个个体FUT 1基因M 857位点的多态性,所检测的3个外来猪种均存在GG和AG两种基因型,而国内地方猪种中除临高猪外均表现为极端的单态分布,只存在GG基因型。采用PCR-SSCP方法对FUT 1基因点突变进行检测,具有试验成本低、操作简便和灵敏度高等优点,可望在育种实践中得到更广泛的应用。

猪源益生菌EP株突变株EP△asd的构建和初步应用

为研制更加安全的大肠杆菌疫苗株,并将其开发为新型活疫苗载体,本研究采用电转化将氯霉素抗性基因片段转化至益生菌EP株。采用同源重组技术使氯霉素抗性基因的PCR产物通过其两侧asd基因序列与益生菌EP基因组中的asd基因发生同源重组。通过氯霉素抗性平板筛选得到阳性克隆,对筛选得到的阳性克隆再导入编码Flp重组酶的质粒p CP20以去除抗性基因,从而构建成EP△asd突变株。该缺失突变株可以与表达链球菌asd基因的质粒形成功能性互补,转化有上述质粒的EP△asd突变株可长时间定居于仔猪肠道。本研究为进一步开发以益生菌EP△asd为染色体—质粒平衡致死系统宿主菌的用于预防仔猪肠道性传染病的细菌活载体疫苗研究奠定基础。

ICR鼠皮肤Sonic Hedgehog(Shh)基因的克隆及表达

目的:检测ICR胎鼠皮肤组织克隆Sonic Hedgehog(Shh)基因在胎鼠皮肤的表达。方法:分离12.5～16.5 d胎龄的胎鼠背部皮肤,用Trizol-酚-氯仿抽提法提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增胎鼠皮肤Shh全部编码基因,重组于pMD19-T载体进行克隆测序分析。应用合成地高辛标记的反义Shh-mRNA探针,整体原位杂交技术检测Shh基因在ICR鼠皮肤上的表达。结果:从15.5 d胎鼠背部皮肤中成功扩增Shh基因,Blast分析与GeneBank公布的Shh基因编码区一致。同时15.5 d以后胎鼠背部皮肤检测到Shh基因的表达。结论:Shh基因可能参与了皮肤毛囊的形成。

鸭不同肠段内菌群结构分析与拟杆菌分布研究

旨在分析健康鸭十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物菌群组成、多样性特征以及拟杆菌分布。本研究选择健康高邮鸭20只,公母各半,70日龄时无菌采集十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物,提取肠道内容物细菌基因组,利用IonS5TMXL平台进行高通量测序,分析肠道内容物菌群结构与丰度特征以及拟杆菌的分布。结果表明,十二指肠、空肠内容物菌群丰度显著高于回肠和盲肠内容物(P<0.05),回肠内容物菌群多样性最低;十二指肠和空肠内菌群群落结构较为相似,与回肠,特别是盲肠的相似度较小。健康鸭肠内优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)和梭杆菌门(Fusobacteria),上述菌门在各肠段内容物中相对丰度不同;不同肠段内容物中定植了不同差异微生物物种,十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物中差异菌门分别是变形菌门、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门和拟杆菌门。鸭肠道中共分析到28种拟杆菌种,其中B.acidifaciens、B.barnesiae、B.caccae、B.caecicola、B.coprocola、B.sp和B.luti在盲肠内容物中显著聚类,且B.caecigallinarum、B.plebeius和B.barnesiae在鸭盲肠中优势定植。结果显示,鸭肠段空间显著影响了其内容物中菌群丰度与多样性,不同肠段内定植了差异的优势微生物物种,这可能与肠段小环境以及功能一致,在盲肠内容物中优势定植拟杆菌,推测可能与鸭盲肠生理生化功能相关。

丁酸梭菌、枯草芽孢杆菌对高邮鸭盲肠菌群结构的影响研究

试验旨在研究饲粮中添加丁酸梭菌或枯草芽孢杆菌对高邮鸭盲肠菌群结构的影响。选择1日龄健康、体重相近的高邮鸭90只,随机分成3组,每组3个重复,每个重复10只,试验期60 d。对照组饲喂基础日粮,丁酸梭菌组、枯草芽孢杆菌组分别在基础日粮中添加0.03%丁酸梭菌、0.05%枯草芽孢杆菌。结果显示,饲粮添加0.03%丁酸梭菌或0.05%枯草芽孢杆菌显著增加60日龄高邮鸭体重(P<0.05),提高饲料转化率;与对照组相比,饲粮添加0.03%丁酸梭菌或0.05%枯草芽孢杆菌可显著降低PD whole tree指数(P<0.05),显著降低梭杆菌门、密螺旋体属和梭杆菌属相对丰度(P<0.05);与对照组相比,饲粮添加0.03%丁酸梭菌显著增加巨单胞菌属和卡拉杆菌属相对丰度(P<0.05),饲粮添加0.05%枯草芽孢杆菌可显著降低厌氧螺菌属相对丰度(P<0.05);对照组、丁酸梭菌组和枯草芽孢杆菌组的差异菌属分别为梭杆菌属、巨单胞菌属和密螺旋体属。综上所述,饲粮添加0.03%丁酸梭菌或0.05%枯草芽孢杆菌后,高邮鸭盲肠微生物梭杆菌等有害菌相对丰度减少,调节肠道菌群平衡,促进鸭肠道健康。

我国热力杀菌现状分析

杀菌是食品工业质量安全控制的关键工序。将食品加热到某一高温并保持一段时间,使可导致食品腐败变质的微生物失去生命力,以保藏食品的过程称为热力杀菌。热力杀菌实质上是一种热处理过程。目前,出口食品企业对罐藏食品、冷冻水产品、熟制蛋品等均采用此加工工艺,其主要目的是在杀灭有害微生物的同时使食品加热熟化。热力杀菌是食品加工企业产品质量安全控制的关键工序,是HACCP质量管理体系的关键控制点。

热力杀菌移动实验室管理规范

本文介绍热力杀菌移动实验室管理如何从规范标准体系、建立标准方法、建立相关操作准入门槛、建立可追溯体系以及热力杀菌检测报告编写和监督审核的要求5个方面进行规范,并对热力杀菌实验室准入提出一些建议。

雏鸭病毒性肝炎的诊断与防治

鸭病毒性肝炎是危害养鸭业的重大传染病之一，近几年来我省断断续续有鸭病毒性肝炎发生，给养鸭专业户造成了巨大损失，严重挫伤了专业户的积极性和养殖信心。在该病的诊断上，依据其发病日龄、临床症状和病理变化可做出初步诊断，但确诊必须依赖实验室诊断。目前该病防治尚无特效药，故该病重在预防。

浅谈食品进出口环节市场主体责任如何落实

新《食品安全法》已于今年10月1日起正式实施,其明确规定了食品生产经营者是食品质量安全第一责任人,这就要求食品生产经营者一定要不断增强食品安全自律意识和自我管理能力。对于食品进出口环节而言,出口食品生产企业和进口商是落实进出口食品质量安全的市场主体,结合新《食品安全法》相关要求。

单克隆抗体制备技术最新研究进展

单克隆抗体(Monoclonal antibody,MAb)是由单一B细胞克隆产生的针对特异性靶抗原的抗体,主要发挥的生物学功能包括中和抗原、调理细胞吞噬、激活补体以及介导细胞毒作用。MAb具有结构均一、特异性强、排除与其他蛋白抗原的交叉反应等优势,因此被广泛应用于生物医学基础研究和临床诊断治疗的许多领域。从最早的鼠源性MAb研发至全人源MAb,新的MAb制备技术应运而生。目前,应用较为广泛的MAb技术包括杂交瘤技术、噬菌体展示技术和单个B细胞抗体制备技术(图1)。此外,嵌合抗体技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术、酵母细胞展示技术等也可用于MAb制备。本文概述了这几种技术平台的原理及应用,旨在为MAb发展研究提供一定理论参考。

美国《进口海产品监管法案(SIMP)》的实施及对我国打击进口海产品IUU捕捞的借鉴意义

为打击IUU捕捞和海产品欺诈活动,美国国家海洋与大气管理局(NOAA)于2016年12月9日发布了《进口海产品监管法案(SIMP)》最终稿,2017年1月9日起正式生效,2018年1月1日起,法案中涉及的优先品种强制实施,但其中虾、鲍鱼符合日期推迟到2018年12月31日,且最终可能扩大到所有品种。该法案的核心内容是,建立一个海产品追溯信息系统,以确保进口海产品来源的合法性,防止IUU捕捞或欺诈海产品流入美国市场。本文详细介绍了法案起草背景和其主要内容,比较分析了美国SIMP法案与欧盟IUU法规之间的差异,在此基础上对完善我国打击进口海产品IUU捕捞管理措施等方面提出意见建议。

我国首次进口曾祖代白羽肉种鸡

从山东荣成出入境检验检疫局获悉,由山东益生种畜禽股份有限公司首批从波兰进口的4162只哈伯德曾祖代白羽肉种鸡经北京首都机场转运后,顺利抵达位于山东荣成的进境种禽临时隔离场。目前,我国引进肉种鸡最高代次为祖代肉种鸡,引进曾祖代肉种鸡尚属首次,

进口食品农产品检验检疫通关流程初探

通过研究进口食品农产品检验检疫通关流程,找出存在的主要问题及影响因素,提出改进建议,以期为检验检疫部门的体制创新和流程再造研究提供理论依据。