耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a相互作用蛋白的筛选

目的通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白。方法利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a。提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽。结果成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白。所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要。将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段最长者648 bp,最短者334 bp,9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离稳定(SMC)蛋白。9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14～46个氨基酸组成。结论利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽。

HOXB7基因在肺腺癌中的表达及其临床意义

目的检测同源盒基因B7(HOXB7)在肺腺癌中的表达情况,并探讨其临床意义。方法分别应用逆转录PCR(RT-PCR)和Western blotting法检测人正常肺支气管上皮细胞系HBE及4株肺腺癌细胞系A549、H1975、H1650、H322中HOXB7的表达情况。应用免疫组织化学染色及Western blotting法检测HOXB7在75例肺腺癌及配对癌旁正常组织中的表达,并分析其表达与肺腺癌临床病理特征及预后的关系。结果 4株肺腺癌细胞系中HOXB7 mRNA和蛋白的表达水平均显著高于正常肺支气管上皮细胞系(P<0.05)。HOXB7蛋白在肺腺癌及对应癌旁正常组织中的高表达率分别为76.0%(57/75)和9.3%(7/75),差异有统计学意义(P<0.05)。HOXB7蛋白在肺腺癌组织中的表达水平与临床分期、病理分级及淋巴结转移有关(P<0.05),而与性别、年龄无关(P>0.05)。HOXB7低表达者的中位生存期为68个月,高于高表达者的51个月,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HOXB7在肺腺癌中高表达,且与肿瘤的侵袭转移和疾病进展相关,有可能作为肺腺癌早期诊断及评估预后的新靶标。

miR-375调控PDGFC基因表达抑制肝癌血管生成

目的:miR-375已被证明能够抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进肝癌细胞凋亡,本研究旨在探索miR-375对肝癌新生血管生成的影响及其分子机制。方法:利用血管生成相关的功能实验探索miR-375对肝癌新生血管生成的影响;使用生物信息学方法预测miR-375潜在的与血管生成相关的功能靶基因;在肝癌细胞系中过表达和下调表达miR-375,验证miR-375对靶基因的调控作用,并利用双荧光素酶报告实验明确其分子机制;靶基因功能挽救实验明确miR-375通过调控靶基因的表达发挥抑制肝癌新生血管生成的作用。结果:miR-375能够抑制肝癌新生血管生成;血小板源性生长因子C(PDGFC)是miR-375的潜在功能靶基因;miR-375能够直接作用于PDGFC基因mRNA3'-非编码端(3'-UTR)而抑制PDGFC基因表达;miR-375能够通过抑制PDGFC基因表达抑制肝癌新生血管生成。结论:miR-375能够调控PDGFC基因表达抑制肝癌新生血管生成。

HOXA10在肺腺癌中的过表达及其临床意义

目的研究肺腺癌组织和细胞系中HOXA10的表达及其临床意义。方法运用免疫组织化学方法检测75例肺腺癌及其癌旁组织中HOXA10的表达情况,并分析HOXA10的表达与患者的临床特征及5年生存率的相关性。此外利用反转录PCR、Western blot及免疫荧光染色检测正常肺支气管上皮细胞系HBE以及4种肺腺癌细胞系H322、H1650、A549、H1975中HOXA10的表达情况。结果 HOXA10主要表达于胞浆中,且于75例肺腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01),并与肿瘤的浸润深度(P<0.05)及淋巴结转移(P<0.01)有关。而HOXA10高表达与低表达的肺腺癌患者的5年生存率没有显著差异(P>0.05)。反转录PCR、Western blot及免疫荧光染色的结果显示HOXA10在肺腺癌细胞系中的表达明显高于正常肺支气管上皮细胞系。结论 HOXA10高表达于肺腺癌及肺腺癌细胞系中,这可能与肺腺癌的侵袭和恶性淋巴结转移的程度密切相关。

肺腺癌HOXA10基因启动子甲基化的改变及其临床意义

目的探讨肺腺癌HOXA10基因启动子区甲基化改变情况及其与临床病理特征和预后的关系。方法采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)法检测30例肺腺癌标本及其配对癌旁组织标本中HOXA10基因启动子甲基化状态,并分析HOXA10基因甲基化状态与临床病理特征和预后的关系。结果 MSP法检出17例(56.7%)肺腺癌组织HOXA10基因启动子区发生低甲基化改变,其中4例为完全去甲基化改变;而癌旁组织仅有6例(20.0%)HOXA10基因启动子区发生低甲基化改变(P<0.05)。HOXA10低甲基化与肿瘤大小、临床分期及淋巴转移有关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤分化程度无关(P>0.05)。生存分析显示,HOXA10基因低甲基化患者的中位无病生存期为27.0个月,明显低于HOXA10基因甲基化患者的46.0个月(P=0.002)。结论肺腺癌HOXA10基因启动子区低甲基化为频发事件,提示与患者的不良预后有关,可作为判断肺腺癌预后的指标。

阻断PD-L1在增强奥沙利铂治疗原发性肝细胞肝癌疗效中的实验研究

目的初步探讨阻断程序性死亡-配体1(programmed death-ligand 1,PD-L1)在增强奥沙利铂(oxaliplatin,L-OHP)治疗原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)疗效中的作用及其分子机制。方法 L-OHP处理人HCC细胞系HepG2后,q RT-PCR和Western blot检测PD-L1在m RNA及蛋白水平的表达变化,以及细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2)磷酸化水平的改变;建立Hepa1-6细胞C57BL/6J小鼠HCC移植瘤模型,随机分为对照组、L-OHP组、PD-L1单抗组、L-OHP+PD-L1单抗组,计算处理后各组小鼠肿瘤的质量、抑制率和生存时间;体外刺激或抑制HepG2细胞系ERK1/2的磷酸化,L-OHP处理后q RT-PCR和Western blot检测PD-L1的表达变化。结果 L-OHP能显著抑制HepG2细胞系的生长,其IC50分别为20.94 mg/L;L-OHP处理HepG2细胞后,p-ERK1/2和PD-L1的表达量均高于对照组(P<0.05)。小鼠HCC移植瘤模型中,与对照组、L-OHP组和PD-L1单抗组相比较,L-OHP+PD-L1单抗组的肿瘤质量显著减小(P<0.05),肿瘤抑制率大幅提升(P<0.05),生存时间明显延长(P<0.05)。体外刺激ERK1/2的磷酸化后,PD-L1表达显著上调,而抑制HCC细胞株ERK1/2的磷酸化后,L-OHP诱导PD-L1表达升高效应明显受到抑制。结论 L-OHP能通过提高ERK1/2磷酸化水平上调HCC细胞的PD-L1表达,从而导致治疗失败,而联合PD-L1单抗可显著增强L-OHP的抗HCC作用。

肽抗生素hPAB-β抗金黄色葡萄球菌L型活性分析

目的观察毕赤酵母高密度发酵表达的肽抗生素hPAB-β对L型细菌的抗菌活性。方法采用新青Ⅱ纸片扩散法诱导金黄色葡萄球菌标准株ATCC25923L型,通过形态学观察、滤过实验、回复实验以及电镜观察鉴定L型菌;采用酵母高密度发酵制备肽抗生素hPAB-β,通过稀释法检测hPAB-β对L型细菌的抗菌活性并测定其最小抑菌浓度(MIC)。结果用新青Ⅱ可成功诱导金黄色葡萄球菌L型;所得L型菌能通过0.45μm的滤膜;撤去抗生素后,L型能回复为野生菌;电镜下见多数金葡菌L型的细胞壁部分缺失,少数完全缺失;稀释法检测显示hPAB-β对金葡菌L型具有良好的抗菌活性,其MIC值为32μmol/L。结论肽抗生素hPAB-β对金葡菌L型有良好的抗菌活性。

阿帕替尼联合替吉奥治疗晚期直肠癌1例

晚期直肠癌的治疗以FOLFOX/FOLFIRI方案联合放疗为主,但对于PS评分较差、不能耐受多线治疗的患者,临床治疗选择较少。分子靶向药物的出现为晚期结直肠癌患者提供了更加安全有效的治疗）。

柴胡桂枝汤联合盐酸羟考酮缓释片治疗癌性疼痛的临床疗效观察

目的:探讨柴胡桂枝汤联合盐酸羟考酮缓释片治疗癌性疼痛的疗效。方法:80例癌痛患者随机分为对照组和治疗组各40例,参照癌痛规范化疗治疗要求,观察患者生活质量评分改善、不良反应、日均吗啡消耗量、爆发痛频次等指标。结果:治疗组便秘发生率(5.0%vs 22.5%)、总不良反应发生率(47.5%vs 85.0%)均显著低于对照组(P<0.05);治疗组生活质量评分改善[(22.25±6.60)分]显著高于对照组[(17.00±6.07)分](P<0.05);治疗组日均吗啡消耗量[(203.82±52.58)mg]显著低于对照组[(245.09±67.57)mg](P<0.05);治疗组累积爆发痛频次(10.58±1.80)显著低于对照组(13.55±2.58)(P<0.05)。结论:柴胡桂枝汤联合盐酸羟考酮缓释片治疗癌痛具有增效减毒之效,更能提高癌痛患者生活质量。

沉默HOXB7基因表达在电离辐射诱导肺腺癌细胞上皮间质转化和迁移中的作用

目的:探讨HOXB7对电离辐射诱导的肺腺癌细胞上皮间质转化和迁移能力的影响。方法:采用Western blot 检测蛋白表达变化,划痕实验和 Transwell迁移实验检测电离辐射对肺腺癌A549细胞迁移能力的影响。结果:用不同剂量X-射线辐照A549细胞,发现2 Gy X-射线辐照HOXB7表达量最高;用2 Gy X-射线辐照A549细胞,发现辐照后第3天HOXB7表达量最高;Western blot 检测发现电离辐射明显上调上皮间质转化标志蛋白的表达;划痕实验及Transwell 迁移实验证明电离辐射增强A549细胞迁移能力。沉默HOXB7 后,电离辐射诱导的A549细胞上皮间质转化及迁移能力明显减弱。结论: HOXB7是电离辐射诱导肺腺癌细胞上皮间质转化和迁移的关键蛋白。