绵羊整联蛋白受体av亚基基因实时定量PCR标准曲线的构建

目的为了建立检测绵羊整联蛋白受体αv亚基基因(ITGAV)mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,构建目的基因ITGAV、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线。方法根据GeneBank中绵羊ITGAV和β-actin基因编码区保守序列,设计特异引物,选择绵羊卵巢组织cDNA为模板进行PCR扩增,产物回收纯化后,与PMD18-T载体连接、转化感受态DH5α,筛选白色菌落并摇菌培养,经PCR和测序鉴定获得阳性ITGAV、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒107～102梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果ITGAV基因相关系数(RSq)=0.998,扩增效率(Eff.)=104.7%;β-actin基因相关系数(RSq)=0.998,扩增效率(Eff.)=111.6%。经熔解曲线分析,ITGAV基因熔解温度为84.66℃,β-actin为86.92℃,2个基因片段的熔解曲线均呈单峰,扩增曲线呈典型的S型动力学曲线,指数扩增期和平台期十分明显,表现为理想的扩增曲线。结论成功构建目的基因ITGAV、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线。