综合性医院样本库的标准化操作流程及临床样本特征分析

中山大学孙逸仙纪念医院于2018年3月成立生物样本库,开始系统采集临床样本。为探讨生物样本库标准化操作流程的建立及样本质量监控,本研究对2018年3月1日至2022年3月1日医院样本库的样本数量、类型、病种、出库数量及使用科室等进行统计分析。结果显示,在保证样本质量的基础上,入库样本数量稳步增长;样本类型以血液和组织样本为主,占所有样本的67%和23%;病种类型多且涉及人体各系统,已入库101种疾病类型,呈现综合性医院特点;样本流动性较好,已为13个临床科室提供7055管样本用于临床科研。生物样本库通过标准化流程及样本质量控制,为转化医学研究提供优质的临床样本资源和实验数据支撑。

KIF3A在单侧输尿管梗阻小鼠肾脏中的表达及意义

目的通过研究KIF3A在单侧输尿管梗阻(UUO)小鼠和TGF-β1诱导的NRK-52E细胞中的表达情况,探讨KIF3A在肾间质纤维化中的作用。方法将36只C57BL/6J小鼠随机分为假手术组(Sham,n=18)和单侧输尿管梗阻组(UUO,n=18),分别于术后7、14、21 d处死小鼠。苏木素-伊红(HE)染色、马松(Masson)三色法染色和天狼星红(Sirius Red)染色观察小鼠肾间质纤维化程度,RT-PCR、免疫组织化学(IHC)和免疫印迹(Western blot)检测小鼠肾组织KIF3A的表达和分布。免疫印迹检测小鼠肾组织KIF3A、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。TGF-β1诱导NRK-52E细胞转分化后,免疫印迹检测KIF3A、E-cadherin、α-SMA、Wnt4和β-catenin蛋白的表达。结果与Sham组相比,UUO小鼠肾间质纤维化程度随着梗阻时间延长而增加,表明造模成功。同时,KIF3A mRNA和蛋白表达均增高,于21 d达到高峰,α-SMA蛋白表达显著上调,E-cadherin蛋白表达明显降低。NRK-52E细胞发生转分化时,KIF3A蛋白的表达增多(P<0.001),同时wnt/β-catenin信号通路中Wnt4和β-catenin蛋白表达增加(P<0.05,P<0.0001)。结论KIF3A可能通过wnt/β-catenin信号通路介导的上皮细胞-间充质转化参与肾纤维化的发生发展过程。

miR-483-5p通过靶向FKBP4加重顺铂诱导的小鼠卵巢损伤

目的探讨FKBP4蛋白在顺铂诱导的早发性卵巢功能不全(POI)中的作用及其机制研究。方法采用ITRAQ技术测定4对顺铂诱导的小鼠POI模型组及生理盐水对照组卵巢组织的差异蛋白。使用TargetScan软件进行靶点预测,利用qRTPCR和Western blot方法确定顺铂诱导组及生理盐水对照组miR-483-5p及FKBP4的表达水平。收集POI患者及正常患者血清各6例,并利用qRT-PCR检测miR-483-5p表达水平。利用细胞转染及双荧光素酶实验验证miR-483-5p和FKBP4的关系。利用转染和/或顺铂分别处理原代颗粒细胞及KGN细胞系(人颗粒细胞系),将细胞分为对照(NC)组、miR-483-5p组、miR-483-5p+顺铂处理组和miR-483-5p+FKBP4+顺铂处理组。以此验证miR-483-5p、FKBP4在顺铂处理的颗粒细胞中的作用;利用Cre-loxp系统构建卵母细胞特异性过表达miR-483-5p及同窝未过表达的转基因小鼠,用免疫荧光、原位杂交及ELISA检测卵巢功能。结果与生理盐水组相比,顺铂诱导的POI小鼠的卵巢中FKBP4表达下降(P<0.05)。靶点预测软件发现miR-483-5p的潜在靶点是FKBP4,并且较生理盐水对照组,它在顺铂诱导的POI小鼠的卵巢、血清以及POI患者的血清中均高水平表达(P<0.01)。体外实验进一步证实FKBP4是miR-483-5p的作用靶点。人颗粒细胞系及小鼠原代颗粒细胞过表达FKBP4缓解了顺铂联合miR-483-5p过表达引起的细胞凋亡(n=5,P<0.05)。与同窝未过表达的小鼠比较,卵母细胞过表达miR-483-5p的小鼠顺铂诱导造成的卵巢损伤更严重。结论miR-483-5p/FKBP4在顺铂诱导的POI中发挥作用。顺铂诱导的卵巢损伤过程可能与上调的miR-483-5p靶向作用FKBP4,导致的FKBP4表达下降有关。miR-483-5p上调可能增加卵巢对顺铂药物的敏感性,使卵巢功能降低。检测血清miR-483-5p可以用来预测POI的发生和发展。

雌二醇显著上调骨质疏松大鼠成骨细胞内抗氧化酶的表达

目的探讨雌二醇对成骨细胞内抗氧化酶表达的影响及在绝经后骨质疏松中的作用。方法构建去卵巢骨质疏松大鼠模型,随机分为SHAM组(假手术组),OVX组(去卵巢手术组),OVX+E2组(雌二醇+去卵巢手术组),3月后检测以下常规指标鉴定骨质疏松模型是否成功:体质量、血清Ca2+、P、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酯酶(ACP)以及骨密度。同时检测血清活性氧(H2O2)及抗氧化酶γ-GCS、GSH-px和GSH-ST水平;PCR和Western blot检测雌二醇对成骨样细胞MC3T3-E1、MG63和原代成骨细胞(OB)内关键的抗氧化酶γ-GCS mRNA和蛋白表达的影响;mRNA芯片检测雌二醇对成骨细胞前体MC3T3-E1内84种抗氧化酶表达的影响;利用PCR验证筛选出的有变化的抗氧化酶;利用CCK8检测雌二醇和抗氧化剂NAC对MC3T3-E1细胞增殖的影响。结果去卵巢手术组大鼠体质量增加,血清P、ALP、ACP升高,骨密度显著下降,表明造模成功。同时血清活性氧(H2O2)水平显著增加,而抗氧化酶γ-GCS水平显著下降。造模的同时给予雌二醇预防性治疗,可逆转骨质疏松表型,同时抑制血清活性氧水平,并提高抗氧化酶γ-GCS水平;雌二醇上调MC3T3-E1、MG63及OB中关键的抗氧化酶γ-GCS mRNA和蛋白水平;mRNA芯片筛查到雌激素上调MC3T3-E1细胞内6种抗氧化酶(Gpx6、Gstk1、Nos2、Prdx2、Ngb和Ccs)表达;PCR检测发现雌二醇均上调成骨样细胞MC3T3-E1、MG63及OB内Ccs和Ngb mRNA水平;雌二醇和抗氧化剂NAC促进成骨细胞MC3T3-E1增殖。结论雌二醇显著上调成骨样细胞内抗氧化酶γ-Gcs、Ccs和Ngb的表达。绝经后骨质疏松与体内活性氧增高,抗氧化水平下降密切相关。雌激素缺乏可能通过增加成骨细胞内活性氧水平,降低抗氧化酶水平,启动氧化应激级联反应,进而抑制成骨细胞增殖,加重骨质疏松的进程。

在肾脏高效导入miR-483-5p的方法

目的研究在肾脏高效导入目的基因miR-483-5p的方法。方法肾皮质注射miR-483-5p慢病毒:取35只C57BL/6J小鼠,随机分为空白对照组、慢病毒低剂量组(每侧肾皮质注射5μL慢病毒)和慢病毒高剂量组(每侧肾皮质注射20μL慢病毒),注射后7 d和21 d处死取材;构建可诱导全身过表达miR-483-5p的转基因小鼠;利用cre-loxp系统构建肾小管特异过表达miR-483-5p的转基因小鼠。3种模型小鼠利用全自动生化分析仪检测血清中尿素氮(BUN)水平判断肾功能,组织切片HE染色观察肾脏组织结构,TUNEL法检测肾脏细胞凋亡。Real-time q PCR检测miR-483-5p在肾脏的表达。结果 3种过表达miR-483-5p小鼠肾功能均正常,肾脏组织结构无明显变化,肾脏细胞无凋亡。肾皮质注射20μL LV3-miR-483-5p后21 d表达最高(1.2±0.43 vs8.6±1.09,P<0.001)。可诱导全身过表达miR-483-5p的转基因动物在肾脏表达效率较低(0.9±0.09 vs 1.7±0.19,P<0.05),Creloxp转基因小鼠可实现在肾脏特异性表达,且效率较高(1.6±1.13 vs 12.36±3.89,P<0.05)。结论首次构建肾小管特异过表达miR-483-5p的转基因小鼠模型,实现在肾小管特异高效表达,且不影响肾脏结构及功能,可以作为研究miR-483-5p在肾脏中的作用及其机制的良好模型;C57BL/6J小鼠每侧肾皮质注射20μL LV3-miR-483-5p后21 d过表达miR-483-5p效率较高,不影响肾功能,对肾组织无损伤,且模型构建时间较短,为miR-483-5p在肾脏中的作用及其机制研究提供良好的实验模型。