重组人MUC1-MBP融合蛋白的抗肿瘤作用

目的 :研究重组人MUC1 MBP的抗肿瘤作用。方法 :用重组人MUC1 MBP皮下注射途径免疫健康鼠 ,采用MTT法测定小鼠抗MUC1特异的CTL活性 ;通过免疫鼠成瘤及荷瘤鼠治疗实验检测其对肿瘤的预防和治疗作用。结果 :MUC1 MBP免疫鼠CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 (47.7± 4 .3) %和 (6 7.5± 6 .5 ) % ;免疫鼠成瘤结果免疫组小鼠共长 5个肿瘤 ,存活时间明显延长 ,对照组共长 5 1个 ,平均生存时间 2 3d ;荷瘤鼠治疗结果显示治疗组小鼠肿瘤平均体积 386mm3 ,对照组小鼠肿瘤平均体积 4 0 0 0mm3 。结论 :重组人MUC1 MBP具有明显的治疗、预防肿瘤和抑制肿瘤转移的作用 ,有希望发展成人类抗肿瘤疫苗。

重组人MUC1-MBP融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 :以MUC1为靶点研制抗肿瘤蛋白疫苗。方法 :将MUC1基因连入pMAL p2原核表达载体 ,并转化大肠杆菌 ,通过IPTG诱导MUC1表达 ,经Westernblot鉴定 ,Amylose亲和层析纯化蛋白。用MUC1 MBP免疫健康C5 7BL 6小鼠 ,测定其免疫活性 ,通过ELISA测定血清中抗MUC1抗体的效价 ;采用MTT法测定小鼠脾CTL活性 ,通过3H TdR掺入法测定T细胞增殖能力。结果 :成功构建了pMAL MUC1表达载体并得到稳定表达MUC1的菌株 ,鉴定了MUC1在大肠杆菌中的表达 ,纯化了MUC1蛋白。经重组MUC1 MBP免疫的C5 7小鼠 ,血清抗MUC1抗体的效价为 1:5 76 0± 32 2 1;脾CTL对MCF 7及Lewis肺癌细胞的杀伤率分别为 4 7 7%± 4 3%和 6 7 5 %± 6 5 %。结论 :人类重组MUC1融合蛋白可引发小鼠CTL反应和体液免疫应答 ,有希望研制成抗腺癌蛋白疫苗。

激活素受体相互作用蛋白在海马神经细胞中的表达及其作用

目的 在发现和克隆新的激活素受体相互作用蛋白 3(ActRIP3)基因的基础上 ,探讨ActRIP3在海马神经细胞介导激活素信号传导的作用。方法 利用GST- ActRIP3融合蛋白免疫家兔制备抗ActRIP3抗体 ,采用RT -PCR及免疫组化染色分析ActRIP3在脑组织中的表达与分布 ,采用pcDNA-ActRIP3与CAGA -lux质粒共转染海马神经细胞 ,分析信号传导作用。结果RT- PCR及免疫组化染色显示ActRIP3在海马神经细胞中高表达 ,构建的pcDNA- ActRIP3表达载体在体外培养海马神经细胞中可有效表达ActRIP3蛋白 ,过表达ActRIP3可促进激活素诱导的海马神经细胞特异信号传导。结论 ActRIP3具有促进激活素信号传导作用 ,是介导激活素作用于海马神经细胞的关键性信号传导蛋白。

肿瘤免疫治疗的研究进展和发展趋势

随着免疫学技术的进步,大量肿瘤抗原不断被发现。DC摄取肿瘤抗原诱导免疫激活还是抑制,取决于肿瘤细胞释放危险信号(GM-CSF、单核趋化蛋白1、MCP1及热休克蛋白等)还是抑制性信号(TGF-β、IDO和iNOS等)。在危险信号的调节下,激活Th1细胞免疫应答清除肿瘤;而在抑制性信号的作用下,激活Th2应答,不能有效清除肿瘤。肿瘤免疫治疗方面的进展主要表现在抗体疗法、T细胞疗法及肿瘤疫苗。目前至少有7种抗体与化疗药物合用的临床效果已经被证实;尽管抗不同种癌症的抗体种类在逐渐增加,但还需进一步探讨用于抗体治疗的新靶点、开发新抗体及扩大抗体应用的抗肿瘤范围。而T细胞疗法治疗效果不十分理想。大多数肿瘤疫苗处于Ⅰ期和Ⅱ临床试验,但为数不多的Ⅲ期临床试验结果不理想,尚需进一步完善。抗体在免疫监视中的重要作用被逐渐认识,肿瘤免疫预防最终可能成为现实。

dbcAMP诱导的EoL-1分化和凋亡与bcl-2家族的关系

目的:探讨dbcAMP(dbutyrylcyclicAMP)诱导的EoL-1(eosinophilicleukemiacellline)分化和凋亡与bcl-2家族的关系。方法:通过免疫印记和流式细胞仪调查bcl-2家族蛋白在dbcAMP刺激的EoL-1细胞中的表达。结果:EoL-1在正常培养条件下表达高水平的bcl-2、bcl-xL和中等水平的bax,但未表达bcl-xs。dbcAMP诱导了EoL-1细胞下调表达bcl-2和bax及上调表达bcl-xs。结论:dbcAMP诱导EoL-1分化和凋亡与bcl-2的降低以及bcl-xs的升高有关.

OK-432对脐带血初始CD4^+T细胞向Th1细胞分化的诱导作用

目的 :探讨链球菌 OK- 432 ( OK- 432 )的抗肿瘤机理。方法 :采用磁珠法分离脐带血初始CD4+ T细胞 ,经 OK- 432诱导培养后 ,应用酶联免疫吸附测定 ( ELISA)法测定培养细胞上清中细胞因子的水平。结果 :OK- 432刺激脐带初始 CD4+ T细胞分泌 IFN-γ的数量明显增加 ,而 IL- 4产生明显减少。结论 :OK- 432可诱导脐带血初始 CD4+ T细胞向

激活素A对小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬活性的促进作用

目的探讨激活素A对巨噬细胞吞噬活性的促进作用及其机制。方法分别通过中性红试验、鸡红细胞法和流式细胞术,检测激活素A对巨噬细胞系RAW264.7细胞的吞饮活性、吞噬活性以及对MHCⅠ、Ⅱ类分子和CD68表达的影响。结果激活素A可明显促进RAW264.7细胞的吞饮及吞噬活性,对MHCI、II类分子表达没有影响,但可明显上调巨噬细胞表面分子CD68的表达。结论激活素A可促进巨噬细胞系RAW264.7细胞吞噬活性,这与其促进巨噬细胞成熟有关。

激活素A及其ⅡA型受体在小鼠肝损伤模型肝组织中的表达

目的:探讨激活素A及其ⅡA型受体在Con A诱导的小鼠肝损伤模型肝组织中的表达形式及其可能的作用。方法:小鼠尾静脉注射Con A(10 mg.kg-1),每周1次,连续4周,建立小鼠肝损伤模型(n=24),另设正常对照组(n=24),于末次注射后的24、72、120及168 h,各组(n=6)分批检测小鼠血清酶变化及肝脏组织病理损伤程度,同时采用荧光定量RT-PCR法检测激活素A及其ⅡA型受体的表达水平。结果:在末次注射后72 h肝组织病理损伤最为严重,肝小叶结构紊乱,肝细胞索消失,细胞肿胀,呈气球样变,以后逐渐恢复;激活素A蛋白水平及其mRNA表达与其ⅡA型受体mRNA表达呈平行状态,于注射后72 h达高峰,与对照组比较差异具有显著性(P<0.05)。结论:激活素A与其ⅡA受体变化与肝组织病理损伤呈平行状态,提示激活素A可能参与了Con A诱导肝损伤模型小鼠的肝损伤。

FTY720对乳腺癌MCF-7细胞增殖及Bax/Bcl-2基因表达的影响

目的探讨FTY720对人乳腺癌MCF-7细胞增殖及Bax/Bcl-2基因表达的影响。方法 FTY720作用人乳腺癌细胞29 h,观察细胞形态,应用Western印迹检测细胞Bax/Bcl-2基因表达;FTY720作用人乳腺癌细胞48 h,应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率,通过流式细胞术(FCM)检测细胞周期、凋亡率。结果镜下可见FTY720作用组细胞生长不良;MTT法检测到该细胞的增殖受到不同程度的抑制,当FTY720浓度为6 400 ng/ml时,体外培养MCF-7细胞抑制率为62.0%,抑制率呈浓度依赖性(P<0.05);流式细胞术检测分析显示,FTY720可将该细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡率也较对照组明显增加(P<0.05);Western印迹法检测分析显示,实验组细胞中Bax/Bcl-2蛋白表达水平比值均较对照组明显增高(P<0.01)。结论一定浓度的FTY720可抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖,诱导其发生凋亡,激活细胞凋亡基因Bax、抑制原癌基因Bcl-2表达。

激活素结合蛋白阻断激活素诱导鸡胚神经节神经突起生长作用及其机制研究

目的探讨激活素结合蛋白(follistatin,FS)与激活素(activin)调控鸡背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)神经突起生长的作用机制。方法实验采用8d的鸡胚分离背根神经节,观察原代培养鸡胚背根神经节的体外生长情况。结果激活素A促进培养鸡背根神经节神经突起生长,形成密集的网络;激活素结合蛋白与激活素A同时添加培养,呈现剂量依赖性阻断激活素促背根神经节神经突起生长。添加激活素结合蛋白培养的背根神经节上清NO分泌水平明显高于单纯激活素A培养组,统计学比较差异显著(P<0.05);添加激活素结合蛋白培养的背根神经节激活素IIA型受体(ActRIIA)表达水平明显低于单纯激活素A培养组。结论激活素结合蛋白可以阻断激活素A刺激的鸡胚神经节神经突起生长,其作用与阻断激活素A诱导ActRIIA表达、中和激活素A抑制神经损伤因子NO释放作用有关。

检测外周血MUC1蛋白双抗体夹心ELISA方法的建立及初步应用

目的为提高外周血MUC1蛋白检测的敏感度,建立了抗MUC1多克隆抗体的夹心ELISA试剂盒,并对其进行了初步测试。方法首先成功构建-表达并纯化了MUC1-GST和MUC1-MBP融和蛋白;通过免疫家兔和大鼠,获得抗MUC1血清,经饱和硫酸铵沉淀、Protein A/G纯化及抗GST和MBP抗体吸收的进一步纯化获得纯的家兔抗人及大鼠抗人MUC1多克隆抗体;通过凝血酶溶解MUC1-GST获得MUC1标准品。经不同的筛选确立了以家兔抗人MUC1抗体作为包被抗体、大鼠抗MUC1抗体作为检测抗体的双抗体夹心试剂盒,敏感度可达到0.2 ng/ml。结果对32例乳腺癌患者和20例健康受试者外周血血清中MUC1蛋白水平的检测结果显示,乳腺癌患者的阳性检出率达到53.1%(17例/32例),而健康对照组检出率为0。结论本研究建立的抗MUC1多克隆抗体双夹心试剂盒有望应用于临床诊断。

农杆菌介导CBF1基因转化安祖花的研究

[目的]为获得耐低温安祖花奠定基础。[方法]利用农杆菌介导CBF1基因侵染安祖花,并研究不同浓度乙酰丁香酮(AS)和侵染时间对转化后安祖花抗性愈伤组织的存活率和抗性芽分化率的影响。[结果]以重组质粒pBI121-CBF1为模板,利用CBF1cDNA全长的引物序列进行PCR扩增,获得约650bp的片段,表明重组质粒构建成功。在抗性培养基上筛选12周后,部分愈伤组织褐化死亡。用100μmol/LAS作为诱导物质时,抗性愈伤组织存活率和抗性芽的分化率较高。农杆菌侵染时间对转化后愈伤组织存活率和抗性芽分化率有一定影响。[结论]当AS浓度为100μmol/L、侵染时间为10min时,抗性愈伤组织的存活率及分化率最高,分别为48.6%和11.46%。

激活素A对小鼠巨噬细胞分泌IL-1β的影响

目的:探讨激活素A对小鼠腹腔巨噬细胞活性的调节作用及其机制。方法:免疫组化观察激活素ⅡA型受体(ActRⅡA)在巨噬细胞上的表达,ELISA法检测小鼠腹腔巨噬细胞培养上清中IL-1β分泌水平,采用RT-PCR检测小鼠腹腔巨噬细胞IL-1βmRNA、ActRⅡAmRNA及激活素受体相互作用蛋白2(ActRIP2)mRNA的表达。结果:激活素A可以促进原代培养小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β及IL-1βmRNA表达,并呈剂量依赖关系;激活素A对LPS活化的小鼠原代培养腹腔巨噬细胞分泌IL-1β及IL-1βmRNA的表达具有抑制作用,并呈剂量依赖关系。免疫组化染色证实ActRⅡA在巨噬细胞中高表达,激活素A对巨噬细胞表达ActRⅡAmRNA具有促进作用,采用抗ActRⅡA抗体可以阻断激活素A促进IL-1βmRNA表达作用,进一步检测表明激活素作用后ActRIP2mRNA表达亦增加。结论:激活素与LPS比较可能是IL-1分泌的弱激动剂,激活素单独应用显示刺激IL-1分泌作用,而与LPS共同作用,则呈现抑制LPS强刺激作用;激活素可能通过ActRIIA-ActRIP2受体信号传导途径,调控巨噬细胞IL-1β分泌与合成。

大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP)诱导小鼠Th1细胞的活化作用

目的:探讨MBP对小鼠T细胞的调节作用。方法:采用淋巴细胞分层液分离小鼠脾脏淋巴细胞,在体外用MBP刺激淋巴细胞,通过MTT法测定淋巴细胞增殖反应;ELISA检测脾细胞培养上清中细胞因子的分泌水平;MBP免疫小鼠后,ELSPOT检测MBP刺激脾淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数;免疫组化检测MBP与T细胞的结合作用。结果:MBP以剂量依赖关系促进小鼠淋巴细胞的增殖,促进淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ,轻微抑制IL-4的分泌;ELSPOT检测细胞分泌IFN-γ结果显示,MBP可诱导特异性Th1活化,也可刺激非特异性Th1活化;免疫组化结果显示,抗MBP抗体可与经MBP刺激的淋巴细胞发生反应,阳性细胞占总淋巴细胞的37.7%,当MBP采用1∶2 000抗MBP抗体中和后,再与淋巴细胞反应,结果未见阳性细胞。结论:MBP可作用于淋巴细胞诱导非特异性Th1活化,也可通过免疫诱导大量特异性Th1活化;MBP可作为新的免疫增强剂开发利用。

鼠与人MUC1分子同源性位点的分析

目的 分析鼠与人粘蛋白 1(MUC1)的同源性位点。方法 用抗人类MUC1单克隆抗体GP1.4、CA15 3,通过细胞ELISA和Westernblot鉴定鼠Lewis肺癌细胞表面MUC1分子的表达 ,并用蛋白分析软件分析鼠与人MUC1分子的同源性。结果 抗人类MUC1单克隆抗体GP1.4和CA15 3与Lewis肺癌细胞表面MUC1存在交叉反应 ;鼠与人MUC1分子约具有 4 9.1%的同源性。结论 鼠与人MUC1分子具有一定的同源性 ,可用鼠Lewis肺癌细胞作荷瘤鼠研究人类MUC1肿瘤疫苗 ;

人MUC1和鼠Muc1蛋白疫苗抗肿瘤作用的比较

目的:探讨重组人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP疫苗的抗肿瘤作用,为肿瘤疫苗的临床应用提供实验依据。方法:用人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP融合蛋白分别免疫小鼠,实验分为阴性对照组、人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组,ELISA方法分别检测小鼠血清抗人MUC1抗体与抗鼠Muc1抗体的交叉反应;LDH法检测小鼠抗人MUC1和鼠Muc1特异的CTL活性。通过小鼠肺癌转移模型及皮下人乳腺癌移植瘤模型检测人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP免疫诱导的抗肿瘤作用。结果:抗人MUC1抗体和鼠Muc1抗原可产生较强的交叉反应,抗鼠Muc1抗体与人MUC1抗原可产生较弱的交叉反应;人MUC1-MBP和鼠Muc1-MBP免疫均可诱导CTL杀伤活性,对MCF-7细胞杀伤活性分别为(48.7±7.1)%和(54.6±7.8)%,对LLC1细胞杀伤活性分别为(61.9±10.2)%和(43.5±8.4)%。人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组小鼠Lewis肺癌的肺结节转移抑制率分别为94.4%和68.5%;在人乳腺癌移植瘤实验中,人MUC1-MBP组、鼠Muc1-MBP组和PBS组小鼠肿瘤平均体积分别(23.5±15.7)、(56.5±46.7)和(142.8±70.2)mm3,人MUC1-MBP组和鼠Muc1-MBP组肿瘤体积明显小于对照组(P<0.01或P<0.05)。结论:人MUC1和鼠Muc1有共同的B和T细胞表位,人MUC1诱导的交叉反应更强烈;人MUC1-MBP诱导的抗肿瘤活性强于鼠Muc1-MBP抗肿瘤活性;人MUC1-MBP有希望发展成人类抗肿瘤疫苗。