酵母多基因表达载体在纤维素生物转化中应用

构建含酿酒酵母组成型强启动子PGK、G418抗性基因及rDNA片段的整合型载体pScIKP,利用rDNA多个同源重组位点,将外源基因以多拷贝整合到酵母染色体上,无需诱导即可持续表达;利用载体位于表达盒两端同尾酶,可插入多个基因表达盒,实现多基因稳定共表达.为检验共表达情况,反转录从绿色木霉中获得纤维素酶基因eg3和cbh2,克隆并转化获得重组酵母菌株S.cerevisiae-ec.该重组酵母能降解羧甲基纤维素形成水解圈;用羧甲基纤维素还原糖法和滤纸酶活力法测定酶活力,其最适温度和最适pH值与所表达单酶相似,表明共表达未影响两种酶的生物学特性;且双酶具有协同作用,能更有效降解非结晶纤维素.pScIKP载体能成功用于多个外源基因共表达和产物协同作用的研究,为构建能直接降解纤维素的酿酒酵母菌株,实现纤维素可再生能源的生物利用奠定了基础.

肿瘤靶向性细胞穿膜肽的固相合成及体外活性研究

目的采用固相合成法合成以基质金属蛋白酶为靶点的肿瘤靶向性细胞穿膜肽,用5-羧基四甲基罗丹明对其进行荧光标记,并对合成的产物进行生物活性和细胞毒性评估。方法采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基酸的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽,并在有耦合剂HATU和DMF的情况下,加入5-羧基四甲基罗丹明进行荧光标记,应用高效液相色谱分析仪和质谱仪测定其纯度和分子量;荧光显微镜观察穿膜肽对体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝脏细胞株LO2的穿膜效果,以评价穿膜肽的生物学活性;MTT比色法检测穿膜肽对SMMC-7721细胞活性的影响。结果所合成的细胞穿膜肽经高效液相色谱法鉴定纯度为96.05%,经质谱鉴定相对分子量为3504.9。这种穿膜肽对正常肝脏细胞株LO2无明显穿膜作用,但对肝癌细胞株SMMC-7721有较强的穿膜作用,并且对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法成功合成细胞穿膜肽;所合成的细胞穿膜肽具有肿瘤靶向性。

HGF与CTLA-4Ig双基因修饰增强脐带间充质干细胞的免疫抑制和促增殖作用

【目的】探讨人脐带间充质干细胞(hUCMSC)经肝细胞生长因子(HGF)和细胞毒性T细胞相关抗原4免疫球蛋白(CTLA4-Ig)双基因修饰后免疫调节能力的变化及其促进肝细胞增殖作用的影响。【方法】酶联合消化法提取并鉴定人脐带间充质干细胞;对照组的hUCMSC转染携带绿色荧光蛋白(EGFP)基因的Ad5-EGFP,实验组的hUCMSC转染携带HGF和CTLA-Ig双基因的腺病毒Ad5-HGF/CTLA-4Ig。流式细胞仪检测对照组hUCMSC转染Ad5-EGFP后72 h表达EGFP细胞比率;实验组Ad5-HGF/CTLA-4Ig转染hUCMSC 72 h后,CCK8检测细胞存活率,同时再次检测hUCMSC免疫表型和向成骨细胞分化的能力,ELISA检测细胞上清中HGF含量,Western blot检测细胞中CTLA4-Ig蛋白的表达水平,通过CCK8法检测双基因修饰后hUCMSC对淋巴细胞增殖的影响及其上清对L02细胞增殖的影响。【结果】携带外源基因的腺病毒可有效转染hUCMSC,不影响其干细胞特性和多向分化能力,经HGF/CTLA-4Ig基因修饰hUCMSC可分泌高浓度HGF并高表达CTLA-4Ig,同时能有效地抑制淋巴细胞增殖,其上清能明显促进肝细胞增殖。【结论】hUCMSC经HGF/CTLA-4Ig基因修饰后生物学特性无明显改变,并能高表达HGF和CTLA-4Ig,其免疫调节及促进肝细胞增殖的能力进一步加强,为肝移植术后存在的肝细胞损伤的保护治疗提供了新思路。

绿色木霉EGⅢ基因的克隆及其在工业酿酒酵母中的整合表达

通过RT-PCR从绿色木霉AS3.3711中克隆得到EG Ⅲ基因,序列分析显示该基因编码序列全长为1257 bp,编码418个aa,且自身带有21个aa的信号肽序列,与里氏木霉eg3的同源性为99.6%。将该基因连入酿酒酵母多拷贝整合型表达载体pScIKP中获得重组质粒,线性化后电转化酿酒酵母工业菌株AS2.489,通过SDS-PAGE蛋白电泳、刚果红染色和酶活测定对转化子进行了分析。结果表明:转化子有明显的重组EG Ⅲ表达带,能够产生CMC水解圈,说明eg3基因已在酿酒酵母中获得了正确的分泌表达,表达EG Ⅲ的重组菌产酶高峰出现时间为60 h,最高酶活接近120 U/mL,重组酶EG Ⅲ的最适温度为60℃,最适pH为6.0,转化子的遗传稳定性达到99.17%,实现了绿色木霉eg3基因在工业酿酒酵母中的稳定高效表达。

嵌入地域文化标识对农产品区域品牌消费者品牌态度的影响研究

从农产品区域品牌嵌入地域文化标识的视角出发,基于匹配性理论,探讨地域文化标识(嵌入或未嵌入)和品牌标识(端正或倾斜)对农产品区域品牌消费者品牌态度的作用机理。研究发现,相比于没有嵌入地域文化标识,农产品区域品牌嵌入地域文化标识更能激发消费者积极的品牌态度,匹配性感知在这一过程中发挥中介作用;相比于倾斜的品牌标识,嵌入地域文化标识的农产品区域品牌使用端正的品牌标识更能激发消费者积极的品牌态度,品牌标识在地域文化标识对消费者品牌态度的影响中发挥调节作用。本研究厘清了地域文化标识对消费者品牌态度的作用机理,阐释了品牌标识的作用,为农产品区域品牌管理者设计地域文化标识和品牌标识提供了依据。

5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635对肝癌细胞的抑制作用

目的:研究5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在体外对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的特异性杀伤作用。方法:将SG600载体中5型腺病毒(Ad5)纤毛蛋白的knob和shaft结构域替换为35型腺病毒(Ad35)纤毛蛋白的相应结构域,构建成5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635。流式细胞术检测5/35嵌合型腺病毒Ad5/35-EGFP对HepG2和SMMC-7721细胞的感染效率,体外病毒增殖实验观察溶瘤腺病毒SG635的增殖能力,Western blotting检测SG635感染后肝癌细胞中E1A蛋白的表达,CCK-8实验检测SG635对肝癌HepG2和SMMC-7721细胞的杀伤作用。结果:在肝癌HepG2和SMMC-7721细胞中,Ad5/35-EGFP的感染效率明显强于5型腺病毒Ad5-EGFP;5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635在HepG2和SMMC-7721细胞中72 h的增殖倍数高于5型溶瘤腺病毒SG600(15 848.93vs6 309.57,6 309.57vs5 011.87,均P<0.01),而在人正常成纤维细胞BJ中几乎不增殖。SG635感染后,HepG2和SMMC-7721细胞中E1A蛋白表达高于SG600感染,在BJ中则无E1A表达。在一定MOI范围内,SG635对于HepG2细胞和SMMC-7721细胞的杀伤作用逐渐增强,且杀伤率明显强于SG600(MOI为1时,90%vs60%;MOI为10时,90%vs50%),对BJ无杀伤作用。结论:5/35嵌合型溶瘤腺病毒SG635能够高效感染并特异性杀伤肝癌细胞,具有较好的靶向性和安全性。

课堂教学中如何培养学生的地理情感

传统的课堂教学是以知识目标为本位的，教师在教学中过于注重知识目标的达成，而忽视了对学生地理意识、学习兴趣、文化情操、审美情趣等诸多方面的培养，忽视情感教育与认知教育的良性互动和相互促进作用。现代教学要求摆脱唯知主义的框框，进人认知和情感和谐统一的轨道，从而促进学生素质的全面发展。本文仅就在课堂教学中如何培养学生的地理睛感谈几点粗浅的认识。

成功是成功之母——用“表扬”方法激励学生一席谈

从青少年学生的心理特点看，他们都渴望得到别人尤其是师长的肯定和赞许，渴望得到愉快的心理体验。班主任更应充分考虑和抓住学生的这种心理特点，正确运用表扬的方法，对学生的良好言行和取得的进步，及时予以肯定和赞扬，使学生时时刻刻体验到成功的喜悦，从中受到鼓舞激励。

高敏与普通荧光定量PCR技术在不同病毒载量慢乙肝患者HBV-DNA检测的一致性及应用价值

目的比较高灵敏度与普通荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法对乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)定量检测结果的相关性与一致性。方法收集2020年8月-2021年6月中山大学附属第三医院感染性疾病科门诊患者的血浆标本511份。以Bland-Altman图分析2种检测方法间绝对与相对偏差,以组内相关系数(ICC)评价方法间一致性。高敏法HBV-DNA检出率与临床指标的关系用χ^(2)检验分析。结果在收集的511份慢性乙型肝炎(CHB)患者样本中,高灵敏度与普通荧光定量PCR法在<2×10^(3)、2×10^(3)~<2×10^(6)和2×10^(6)~IU/mL组的ICC分别为0.54、0.80和0.66,差异有统计学意义(P<0.05)。Bland-Altman法也显示类似的结果。对于HBV-DNA低于检测下限(普通PCR法)的样本,乙型肝炎表面抗原(HBsAg)≥1000 IU/mL、丙氨酸氨基转移酶(ALT)异常和未治疗的高灵敏度法检出率显著高于HBsAg<1000 IU/mL、ALT正常和抗病毒治疗(χ^(2)=6.67、5.00、30.51,P均<0.05)。结论普通荧光定量PCR法与高灵敏度法HBV-DNA结果存在差异,且在低病毒载量的样本中,两种方法的一致性较低。对于低水平病毒血症、普通法HBV-DNA检测低于检测下限、ALT异常、HBsAg≥1000 IU/mL、尚未进行抗病毒治疗的CHB患者,建议使用高灵敏度HBV-DNA进行检测。

微小RNA在肝细胞癌中的研究进展

微小RNA（micro RNA,mi R）是一类内源性非编码RNA,作为重要的调控因子,可以通过影响功能基因的表达,实现对肿瘤细胞增殖、凋亡、分化和转移功能的转录后水平调节。mi R在包括肝细胞癌（肝癌）在内的多种恶性肿瘤中存在异常表达,有望成为肿瘤诊断筛查的生物标记或基因治疗的良好靶点[1]。肝癌的发生、发展是一个多基因参与、多步骤完成的过程[2]。

打造“有质量的牛市”

股市处于资源配置的前沿,打造出公平公正公开、信号反应准确灵敏、人气旺盛信心充盈的股市,才能让其在资源配置的舞台上担当起主角。

战略性新兴产业融资难题

战略性新兴产业的培育和发展是一个长期、持续的过程，初期高投入、高风险的特征十分明显。

中关村银行:创业者不再孤独

中关村银行的核心在于“中关村”三个字，这里有最佳的科技创新生态、最优秀的高新技术、高成长企业，这也是中关村银行的核心竞争力。

肝细胞肝癌患者血清和肝癌组织中fibulin-1蛋白的表达及其临床意义

目的探讨fibulin-1蛋白在肝细胞肝癌(肝癌)患者血清和肝癌组织中的表达水平及其临床意义。方法本前瞻性研究对象为2009年5月至2010年5月在中山大学附属第三医院行肝癌肝切除术,且经临床病理确诊为肝癌的40例患者(肝癌组)。患者均签署临床研究知情同意书,符合医学伦理学规定。肝癌组男36例,女4例;年龄(48±14)岁。另取同期在本院体检的48例健康人作为正常对照组(对照组)。肝癌组的血液样本于术前检查时抽取,对照组于体检时抽取。应用酶联免疫吸附试验检测血清fibulin-1蛋白水平。取8例肝癌患者的肝癌和癌旁组织,应用蛋白质印迹法检测fibulin-1蛋白相对含量。两组间的fibulin-1蛋白表达水平及肝癌组织和癌旁组织fibulin-1蛋白相对含量比较采用t检验。结果肝癌组患者血清fibulin-1蛋白表达水平为(44±8)mg/L,对照组为(30±9)mg/L,肝癌组血清fibulin-1蛋白表达水平明显高于对照组,差异有统计学意义(t=-7.02,P<0.05)。肝癌组肝癌及癌旁组织fibulin-1蛋白相对含量分别为0.65±0.25、0.24±0.06,两组差异有统计学意义(t=-2.70,P<0.05)。肝癌组患者血清fibulin-1蛋白表达水平与肿瘤血管浸润及肿瘤、淋巴、转移(TNM)分期相关(t=-6.12,-3.50;P<0.05),而与甲胎蛋白(AFP)含量、肿瘤大小和数目无关(t=-0.48,1.34,-1.29;P>0.05)。结论肝癌患者血清fibulin-1蛋白表达水平升高,肝癌组织的fibulin-1蛋白含量亦较癌旁组织升高,血清fibulin-1蛋白表达水平与血管浸润和TNM分期有关,fibulin-1蛋白可能参与肝癌的发生、发展。

肝癌相关成纤维细胞对肝细胞肝癌影响的实验研究

目的探讨肝癌相关成纤维细胞(hCAF)对肝细胞肝癌(肝癌)转移的影响。方法分别将hCAF和正常成纤维细胞(NF)培养2~3 d,行免疫荧光染色,观察hCAF和NF细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞表面蛋白(FSP)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、波形蛋白(vimentin)的表达情况。通过hCAF与MHCC97L-绿色荧光蛋白(GFP)、HepG2-GFP肝癌细胞共培养及划痕实验,观察hCAF对肝癌细胞的形态变化的影响及其对肝癌侵袭转移能力的作用。结果 hCAF和NF细胞均表达α-SMA、FSP、FAP、vimentin,但hCAF表达α-SMA与FAP的水平明显高于NF。hCAF与肝癌细胞共培养至96 h,MHCC97L-GFP细胞生长由典型的抱团样成簇生长,变成分散呈播散样生长;HepG2-GFP细胞由多角形的上皮细胞形态转变为长梭形的间质细胞形态。MHCC97L-GFP、HepG2-GFP肝癌细胞与hCAF共培养5 d后划痕明显较NF组缩小。结论 hCAF能加速肝癌细胞发生类似上皮细胞间质转型的变化,增强肝癌细胞侵袭转移能力。

红色旅游资本困局

今年5月19日，是第一个“中国旅游日”，随着中国共产党成立90周年纪念、辛亥革命100周年纪念等重要时问节点的日益临近，许多地区纷纷将红色旅游确定为旅游目的主题活动之一，结合自身红色资源优势，推出一系列旅游新项目，各种不同风格、不同主题的红色旅游线路正进一步升温。

Fibulin-1蛋白的真核表达与ELISA检测方法的建立

目的建立检测血清中Fibulin-1蛋白浓度的ELISA方法。方法构建Fibulin-1蛋白真核表达载体，以人Fibulin-1基因编码序列为模板，将目的片段定向克隆入载体并转入毕赤酵母菌，进行Fibulin-1蛋白的真核表达。表达产物纯化后，Westernblotting检测证明纯化的重组蛋白的抗原特异性。以该蛋白为定标绘制标准曲线，建立人血清ELISA检测方法并检测其精密度和回收率，最后初步分析人血清中Fibulin-1的含量。结果从真核表达体系获得了纯化的Fibulin-1蛋白，其具有良好的抗原特异性；建立的ELISA方法线性相关系数W=0．98，线性范围为12．5—800ng／mL，检测灵敏度为6．25ng／mL，蛋白回收率在94．33％～109．33％之间，CV均〈10％，具有良好的重复性；检测30例正常人血清样本中Fibulin-1的含量约为（31±8）μg／mL。结论建立的ELISA方法可用于检测血清中的Fibulin-1蛋白含量。

溶瘤腺病毒SG611联合顺铂对肝癌细胞HepG2的协同杀伤作用及其机制

目的探讨溶瘤腺病毒SG611联合顺铂(DDP)对肝细胞癌(肝癌)细胞Hep G2的协同杀伤作用及其作用机制。方法利用携带GFP的腺病毒载体SG611感染人肝癌细胞Hep G2,流式细胞术检测SG611感染效率,CCK-8实验检测SG611联合DDP对肝癌细胞Hep G2杀伤效应,结晶紫染色法观察细胞毒性作用;4'6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法检测细胞凋亡率,Western blot检测E1A蛋白的表达。实验数据比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。结果 SG611-EGFP感染肝癌细胞Hep G2荧光显微镜下观察,随着感染复数(MOI)的增加,GFP阳性细胞数目明显增加,流式细胞术检测SG611的感染效率分别为0.18%、6.36%、50.60%、73.20%、86.80%、90.50%,呈剂量依赖性。MOI=10的SG611与1.5μg/ml的DDP联合应用的细胞存活率为(33.2±1.2)%,明显低于单用SG611的(88.8±8.9)%(LSD-t=-7.83,P<0.05);且联合应用对肝癌细胞Hep G2的细胞毒性作用明显强于单用SG611。两者联合应用时肝癌细胞Hep G2凋亡率为(23.9±1.5)%,明显高于单用SG611、DDP的(15.3±1.0)%、(12.4±1.1)%(LSD-t=10.56,21.34;P<0.05);且联合应用时肝癌细胞Hep G2的E1A表达明显增强。结论溶瘤腺病毒SG611联合DDP对肝癌细胞Hep G2具有协同杀伤作用。SG611增加DDP化疗敏感性及DDP增强SG611增殖能力可能为其协同杀伤的作用机制。

科技重塑金融业态

金融行业由于其重要的战略地位和天然的数字属性，始终面临着政策和技术双轮变革的调整。如何用技术破局，创新业务流程和服务品类，为实体经济服务，成为行业面临的核心命题。

内乡农商银行:因地制宜助力精准扶贫

内乡农商银行充分发挥金融在精准扶贫中的动力引擎作用，有效促进了金融助推脱贫攻坚工作的扎实推进。