PRRSV河南株ORF7基因的克隆表达及条件优化

从猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)河南分离株(HN07-1、HN07-2)的细胞培养物中提取RNA,根据参考株IAF-exp91 N蛋白基因序列设计出2对引物,成功克隆出ORF7全长基因,并连接至pMD-19T载体。基因测序结果表明,2株PRRSV河南分离株ORF7基因序列完全相同;该序列与HB-4(hs)同源性为100%,与标准美洲株VR-2332和我国早期分离的BJ-4株同源性为93.8%。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1后,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达并对表达条件进行优化。SDS-PAGE和Western-blot结果表明,成功表达了约40 kD的融合蛋白;使用1.0 mmol/L的IPTG在2×YT培养基中诱导8 h可获得最大表达量。

人热休克蛋白10和鼠热休克蛋白10的克隆、序列分析及其原核表达

提取人肝癌SMMC-7721细胞和小鼠NS0细胞总RNA,对热休克蛋白10基因(Hsp10)进行RT-PCR扩增、TA克隆和测序。结果表明,从上述2种细胞中获得的cDNA分别由312,313 bp组成,与报道的人HSPE1 mRNA(NM-002157)、鼠肌肉Hspe1 mRNA(NM-008303)序列同源性分别为99%,97%,命名为HSPE1-1和Hspe1-1,序列分析表明,二者之间在核苷酸水平上的同源性为92%,氨基酸水平上的同源性为97%。将上述2种cDNA进行双酶切、亚克隆,成功构建了重组表达载体pET-28a-HSPE1-1与pET-28a-Hspe1-1,转化大肠杆菌并进行了诱导表达。检测结果表明,pET-28a-HSPE1-1与pET-28a-Hspe1-1均能在大肠杆菌中表达,表达蛋白分子量大小约为14 kDa,与预期大小一致。Western-Blot结果证实了其为目的蛋白,经镍树脂柱纯化,获得了相应的重组蛋白。为进一步研究这2种蛋白的结构、功能及临床应用奠定了基础。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α(nsp1α)的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病之一,其致病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抑制宿主的天然免疫和特异性免疫反应,引起机体免疫抑制,造成持续性感染,从而给该病的防控带来困难。NLRP3炎症小体作为先天性免疫的重要组分在机体抗病毒中发挥重要作用。前期研究发现PRRSV能够激活NLRP3炎症小体,但PRRSV是否存在拮抗NLRP3炎症小体的组分还未见报道。本研究首先在缺失内源性炎症小体的HEK293T细胞中,共转染NLRP3、ASC、procaspase-1和pro-IL-1β四个真核表达质粒,建立NLRP3炎症小体的体外研究模型。然后,在该炎症小体模型细胞和猪肺泡巨噬细胞中,转染PRRSV nsp1α的真核表达质粒,结果表明nsp1α能够明显拮抗炎症小体的活化,而进一步的突变试验表明缺失N端锌指(ZF)结构或者突变ZF结构的nsp1α均不能抑制NLRP3炎症小体活化。本研究不仅首次发现了拮抗NLRP3炎症小体活化的PRRSV蛋白——nsp1α,而且发现nsp1α的N端锌指结构是其抑制NLRP3炎症小体活性所必需。本研究进一步发现了PRRSV拮抗天然免疫的新机制,并为PRRSV的防控提供了潜在的分子靶点和理论指导。

猪伪狂犬病毒的增殖、纯化和鉴定

以伪狂犬病毒(PRV)活疫苗Bartha弱毒株接种于幼仓鼠肾细胞(BHK-21)使其增殖,通过PCR方法鉴定了病毒。以组织细胞半数感染剂量(TCID50)对病毒效价进行了评定,利用蔗糖密度梯度离心法纯化了病毒。结果表明,培养的病毒滴度为103.25TCID50/mL,纯化后的病毒经SDS-PAGE电泳显示,获得了较纯的蛋白条带。

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测

为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。

甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究

为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2(MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pcDNA3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-MBD2,用pcDNA3.1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRT-PCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。

稳定表达靶向BVDV shRNA细胞系的建立及其对BVDV复制的影响

为研究靶向牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的shRNA对BVDV复制的影响,利用脂质体介导法将BVDV shRNA真核表达质粒pSGH1-sh1083和pSGH1-sh8235及对照质粒pSGH1转染MDBK细胞,通过G418抗性以及有限稀释法筛选获得BVDV shRNA单克隆细胞系subclonepSGH1-1083和subclonepSGH1-8235及对照细胞系subclonepshmock。通过观察其细胞病变效应(CPE)、测定TCID50及RT-PCR、流式细胞术检测BVDV shRNA细胞系对BVDV复制的影响。结果表明,与阴性对照组相比,单克隆细胞系subclonepSGH1-1083和subclonepSGH1-8235的细胞在感染BVDV 72h后CPE不明显,其TCID50低于阴性对照组;RT-PCR结果显示,单克隆细胞系subclonepSGH1-1083和subclonepSGH1-8235的细胞在感染BVDV后病毒E2基因的表达减弱;流式细胞术检测不同细胞系接毒24h后的结合率,单克隆细胞系subclonepSGH1-1083和subclonepSGH1-8235与病毒结合率分别为11.37%和11.51%,与对照组(20.25%)相比有所降低。综上,稳定转染BVDV shRNA的单克隆细胞系subclonepSGH1-1083和subclonepSGH1-8235对BVDV的复制具有抑制作用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株GP4蛋白的原核表达与纯化

【目的】原核表达和纯化猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的结构蛋白GP4,为深入了解其结构和功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR方法扩增PRRSV BJ-4株ORF4基因片段,将其克隆到pMD19-T载体中并进行测序。从测序正确的重组质粒pMD19-T-ORF4中扩增缺失N端及C端疏水序列的基因片段tGP4(truncated GP4),再将其亚克隆到pET-32a载体并转化到大肠杆菌BL21,IPTG进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行可溶性分析,使用尿素梯度法进行蛋白纯化,并通过ELISA法检测重组蛋白的免疫活性。【结果】RT-PCR获得了537bp的ORF4。成功构建了原核表达载体pET-32a-tGP4,在IPTG诱导后重组蛋白以包涵体的形式大量表达。使用尿素梯度法获得了纯度较高的目的蛋白,纯化的目的蛋白能与PRRSV阳性血清特异性结合。【结论】使用原核细胞成功表达了PRRSV的结构蛋白GP4,纯化后的重组蛋白具有很好的免疫原性。

猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白1α多克隆抗体的制备及应用

以真核质粒pcDNA3.1-flag-nsp1α为模板,利用PCR扩增出nsp1α基因片段,构建原核重组载体pET32a-nsp1α,转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态,1mmol/LIPTG在37℃诱导表达6h,成功获得以包涵体形式存在的重组蛋白,能够与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体复性后作为抗原免疫新西兰大白兔,3次免疫后20d获得兔多抗血清。通过间接ELISA、Westernblot、间接免疫荧光、免疫组化等试验获得了高效价的兔多抗血清,该血清能够特异性地识别真核质粒表达的nsp1α以及PRRSVBJ4株。该试验成功表达了pET32a-nsp1α重组蛋白,并制备了高效价、高特异性的兔抗nsp1α多克隆抗体。

核因子I/A(NFIA)依赖其N末端的DNA结合结构域抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)严重危害世界养猪业,目前仍无有效防控策略,因此探究宿主内源性蛋白拮抗PRRSV的分子机理意义重大。前期试验发现核因子I/A(nuclear factor I/A,NFIA)可以有效抑制PRRSV复制,故本试验以非洲绿猴胚胎肾细胞Marc-145细胞为模型,对NFIA抑制PRRSV复制的分子机理进行了深入探究。首先,构建NFIA的N末端DNA结合结构域缺失质粒pcDNA3.1-Flag-ΔN和C末端转录激活结构域缺失质粒pcDNA3.1-Flag-ΔC并分别转染Marc-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后用qRT-PCR和Western blot的试验方法分别检测病毒N蛋白的RNA和蛋白表达水平。结果显示ΔC仍能有效降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,但ΔN则不再能降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,这表明NFIA的N末端结构域是抑制病毒的关键。其次,对NFIA全长质粒pcDNA3.1-Flag-WT进行N末端结构域内不同功能位点的双碱基突变,分别破坏掉NFIA的促腺病毒复制功能(Mut1,YR86~87WL)、DNA结合功能(Mut2,LR119~120VD)和二聚化功能(Mut3,LF135~136VD),将突变质粒分别转染Marc-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后通过qRT-PCR和Western blot检测发现,Mut2和Mut3不再能降低PRRSV的RNA水平和N蛋白水平,说明N端结构域的DNA结合功能位点和二聚化功能位点是NFIA抑制PRRSV复制的关键。结果表明,核因子I/A(NFIA)主要依赖其DNA结合结构域的二聚化与DNA结合功能来抑制PRRSV复制。

PRRSV GP2a胞外区的原核表达及免疫原性分析

为获得有活性的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)BJ-4株GP2a胞外区蛋白,以真核质粒pcDNA3.1-ORF2为模板,设计针对GP2a胞外区(41-208aa)的特异性引物,通过PCR等方法,获得重组表达质粒pET-32a-eORF2,转化宿主菌Rosetta(DE3),并用1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。SDS-PAGE结果表明,重组的GP2a胞外区蛋白以包涵体形式表达,相对分子质量约36000;将包涵体纯化、复性后,以50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,三免后,抗体效价达1∶102400;这表明GP2a胞外区成功表达,且具有良好的免疫原性。