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基因工程酵母菌来源的D-氨基酸氧化酶分离纯化 被引量:2
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作者 史训龙 冯美卿 +2 位作者 贺佳音 袁中一 周珮 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2005年第1期71-74,85,共5页
目的 以基因工程酵母表达的胞内D-氨基酸氧化酶(DAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化DAAO。 方法 采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经 DEAE Sephadex A-50,DEAE-DE52,Q-sepharose等... 目的 以基因工程酵母表达的胞内D-氨基酸氧化酶(DAAO)为原料,通过破细胞,分离纯化DAAO。 方法 采用机械研磨,反复冻溶,超声波等多种方法破细胞,获得粗酶液,硫酸铵分段沉淀。沉淀透析后,经 DEAE Sephadex A-50,DEAE-DE52,Q-sepharose等离子交换柱进行第一步分离,获得的含酶粗品,再经Sephaciyl S-100分子筛进一步纯化获得电泳纯的DAAO。结果 超声波破壁为最佳的破壁方法,得到的每毫升酶液所含 的酶活力是其他破壁方法的两倍以上,最高达到12 000 U/mi,。两步硫酸铵沉淀能粗分DAAO,50%硫酸铵沉 淀酶回收率可达85%以上。用Q-sepharose、Sephacryl S-100分子筛柱层析两步纯化,酶活力回收率最高可达 90%,SDS-PAGE显示单一蛋白条带。结论 本实验方法能得到电泳纯的DAAO,总回收率约为40%。 展开更多
关键词 S-100 细胞 法能 透析 分离纯化 电泳 表达 硫酸铵沉淀 基因工程酵母 D-氨基酸氧化酶
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一株新的重组人源过氧化氢酶基因工程菌的构建和遗传稳定性研究 被引量:2
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作者 史训龙 施志慧 +4 位作者 周伟 叶丽 朱海燕 冯美卿 周珮 《工业微生物》 CAS CSCD 2011年第3期1-6,共6页
利用pPICZαA作为新的表达载体和表达宿主酵母Gs115,成功地构建了新的人源过氧化氢酶表达工程菌G13,并考察了新的工程菌G13的遗传稳定性。通过对新的重组菌整合质粒的酶切,PCR鉴定,及SDS-PAGE电泳、单抗dot-blot证实了该重组菌质粒构建... 利用pPICZαA作为新的表达载体和表达宿主酵母Gs115,成功地构建了新的人源过氧化氢酶表达工程菌G13,并考察了新的工程菌G13的遗传稳定性。通过对新的重组菌整合质粒的酶切,PCR鉴定,及SDS-PAGE电泳、单抗dot-blot证实了该重组菌质粒构建正确,可以有效表达重组的人源过氧化氢酶。新的重组酵母菌G13在连续传代24次后,没有发生质粒的丢失现象,表达的过氧化氢酶活力稳定。 展开更多
关键词 人源过氧化氢酶 毕氏酵母 基因工程菌 重组质粒 遗传稳定性
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最新生物药物知识对药学类本科生教育的必要性 被引量:1
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作者 史训龙 朱海燕 +2 位作者 冯美卿 叶丽 鞠佃文 《教育教学论坛》 2013年第17期38-40,共3页
药学类本科生教育涵盖了多门基础和应用学科的知识交叉,既具有理论知识传授,又具有一定的实践能力训练。但在社会分工越来越丰富,以及生物药物蓬勃发展的今天,药学类本科生的就业流向更趋多元化,传统的偏重基础性的生物药学教育已经不... 药学类本科生教育涵盖了多门基础和应用学科的知识交叉,既具有理论知识传授,又具有一定的实践能力训练。但在社会分工越来越丰富,以及生物药物蓬勃发展的今天,药学类本科生的就业流向更趋多元化,传统的偏重基础性的生物药学教育已经不能完全满足现今的社会需求。实时最新的生物药物知识探讨将有助于药学类本科生整合理论知识,了解当今的科学研究热点及重大的社会需求,对培养学生创新精神和能力,完善高校与社会对接具有重要的意义。 展开更多
关键词 药学教育 生物药物 创新
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重组人源过氧化氢酶表达优化和纯化研究
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作者 史训龙 施志慧 +4 位作者 周伟 叶丽 朱海燕 冯美卿 周珮 《工业微生物》 CAS CSCD 2011年第3期71-75,共5页
研究了重组表达人源过氧化氢酶酵母菌株G13的发酵工艺和纯化方法。对接种量、生长期培养基、生长时间、诱导时间等因素进行了优化,并确立了10 L发酵罐的发酵条件。结果表明,菌体最高密度达到了0.15g/mL,比原重组菌株S4提高了1倍,人源过... 研究了重组表达人源过氧化氢酶酵母菌株G13的发酵工艺和纯化方法。对接种量、生长期培养基、生长时间、诱导时间等因素进行了优化,并确立了10 L发酵罐的发酵条件。结果表明,菌体最高密度达到了0.15g/mL,比原重组菌株S4提高了1倍,人源过氧化氢酶表达量也由原来的平均600 U/mL提高到了1500U/mL。同时建立了二步法纯化该酶工艺,获得了电泳纯的人源过氧化氢酶。所得到的重组蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,证实产物为人源过氧化氢酶。 展开更多
关键词 人源过氧化氢酶 毕氏酵母 重组表达 优化 纯化
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病毒感染与氧化应激的关系 被引量:28
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作者 施志慧(综述) 史训龙 +1 位作者 朱海燕 周珮(审校) 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2012年第1期80-85,共6页
病毒感染和氧化损伤密切相关。病毒感染可引起机体广泛的氧化应激反应,并进一步加重疾病。本文针对RNA、DNA及逆转录病毒,尤其侧重于流感病毒、乙肝病毒和人免疫缺陷病毒,从病毒感染诱导产生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)... 病毒感染和氧化损伤密切相关。病毒感染可引起机体广泛的氧化应激反应,并进一步加重疾病。本文针对RNA、DNA及逆转录病毒,尤其侧重于流感病毒、乙肝病毒和人免疫缺陷病毒,从病毒感染诱导产生活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的能力、病毒与ROS的相互影响、病毒在机体氧化/抗氧化平衡中发挥的作用、抗氧化剂在病毒感染中的治疗作用等方面对病毒感染和氧化应激的关系作一综述。 展开更多
关键词 RNA病毒 DNA病毒 逆转录病毒 氧化应激 活性氧自由基 抗氧化剂
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人参皂苷Rd高产突变株Paecilomyces bainier sp229-7的生长特性和生物转化 被引量:7
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作者 周超群 史训龙 +1 位作者 李继扬 周珮 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2010年第1期59-62,67,共5页
目的通过研究突变株拟青霉菌sp229-7(Paecilomyces bainiersp229-7)的生长及转化底物情况,探讨突变株转化三七茎叶总皂苷的高效性。方法在不同条件下,运用摇瓶转化法考查菌株生长和转化底物特性;分别采用静息态细胞、胞外酶以及粗酶液,... 目的通过研究突变株拟青霉菌sp229-7(Paecilomyces bainiersp229-7)的生长及转化底物情况,探讨突变株转化三七茎叶总皂苷的高效性。方法在不同条件下,运用摇瓶转化法考查菌株生长和转化底物特性;分别采用静息态细胞、胞外酶以及粗酶液,测定其对底物转化情况。结果菌体12~48 h之间生长最旺盛,36 h加入底物转化率最高,加入底物后72 h转化基本结束,转化产物只有人参皂苷Rd,底物投料量至少可以达到20 mg/mL,克分子转化率达80%以上,转化温度27℃~32℃之间最佳。静息态细胞、胞外酶以及粗酶液都可以将人参皂苷Rb1转化为人参皂苷Rd。结论与文献报道相比,Paecilomyces bainiersp229-7突变株具有良好的底物耐受性和专一性,快速生长的后期是底物投料的最佳时机,Rb1转化为Rd的时间缩短为3 d,投料量至少增加20倍,显著提高了转化效率,可望应用于工业生产。突变株的高转化效率可能与转化酶由细胞内产生并部分分泌到胞外有关,增加了酶与底物接触机会,避免了产物在胞内过量积累。 展开更多
关键词 人参皂苷RD 生物转化 菌株特性 底物耐受 拟青霉菌sp229-7
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D-氨基酸氧化酶在不同毕赤酵母宿主菌中的表达比较 被引量:4
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作者 冯美卿 黄海 +3 位作者 史训龙 余志良 袁中一 周珮 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第4期572-577,共6页
D 氨基酸氧化酶 (DAAO)在转化头孢菌素C生产 7 ACA和转化DL 氨基酸制备α 酮酸和L 氨基酸上起着重要的作用。采用DNA操作技术 ,将来源于三角酵母的DAAO基因连接至表达载体pPIC3 5K上 ,再将表达质粒pPIC3 5K DAAO分别整合P .pastoris的... D 氨基酸氧化酶 (DAAO)在转化头孢菌素C生产 7 ACA和转化DL 氨基酸制备α 酮酸和L 氨基酸上起着重要的作用。采用DNA操作技术 ,将来源于三角酵母的DAAO基因连接至表达载体pPIC3 5K上 ,再将表达质粒pPIC3 5K DAAO分别整合P .pastoris的宿主细胞KM71和GS1 1 5 ,经筛选获得阳性重组菌PDK1 3(MutS)和PD2 7(Mut+ )。重点对两种突变菌的表达条件进行了比较。结果显示 :PDK1 3(MutS)株比PD2 7(Mut+ )株消耗甲醇慢、诱导时间长 ,但对通气量要求低、表达水平高 ,摇瓶活力分别达到 2 70 0和 2 5 0 0IU L ,1 4L发酵罐内活力分别达到 1 0 1 4 0和 84 6 3IU L。初步探索了DAAO对DL 苯丙氨酸的拆分 ,结果显示基因工程菌表达的DAAO具有良好的转化DL 苯丙氨酸制备苯丙酮酸和L 展开更多
关键词 D-氨基酸氧化酶 甲醇酵母 不同宿主菌 表达比较 DL-苯丙氨酸 拆分
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通过原生质体质粒转化提高Streptomyces actuosus诺西肽产量的研究 被引量:3
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作者 李继扬 史训龙 +4 位作者 冯美卿 万睿 文勇 刘晓会 周珮 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2008年第5期22-26,共5页
研究利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSE34,构建vhb基因的重组质粒pSEVhb,采用原生质体质粒转化法,将携带vhb的重组质粒转入诺西肽产生菌Streptomyces actuosus中,获得重组菌S.actuosus/pSEVhb。通过CO结合试验,证明VHb在重组菌中成功表达... 研究利用大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pSE34,构建vhb基因的重组质粒pSEVhb,采用原生质体质粒转化法,将携带vhb的重组质粒转入诺西肽产生菌Streptomyces actuosus中,获得重组菌S.actuosus/pSEVhb。通过CO结合试验,证明VHb在重组菌中成功表达。限氧试验表明,重组菌S.ac-tuosus/pSEVhb诺西肽的的产量明显高于出发菌株。传代试验重组菌稳定,适合工业化大生产。 展开更多
关键词 活力链霉菌 STREPTOMYCES actuosus 诺西肽 原生质体质粒转化 Vitrecscilla血红蛋白
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小儿感冒颗粒对H1N1流感病毒诱导小鼠急性肺损伤的保护作用 被引量:9
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作者 朱海燕 岑利峰 +2 位作者 史训龙 段娟慧 代志 《中成药》 CAS CSCD 北大核心 2020年第3期758-764,共7页
目的观察999小儿感冒颗粒对H1N1甲型流感病毒诱导急性肺损伤的保护作用。方法经鼻感染甲型流感病毒H1N1建立小鼠流感动物模型,通过生命保护试验和急性肺损伤试验,观察999小儿感冒颗粒对流感病毒感染鼠的生命保护作用以及抗炎、免疫调控... 目的观察999小儿感冒颗粒对H1N1甲型流感病毒诱导急性肺损伤的保护作用。方法经鼻感染甲型流感病毒H1N1建立小鼠流感动物模型,通过生命保护试验和急性肺损伤试验,观察999小儿感冒颗粒对流感病毒感染鼠的生命保护作用以及抗炎、免疫调控、抗病毒、抗氧化作用。结果 999小儿感冒颗粒低、中、高剂量组能延长病毒感染鼠的生命存活时间,生命延长率分别达到11.8%、19.1%、47.2%。999小儿感冒颗粒高剂量组在14 d的观察周期中,生命存活率达到91.7%,较模型组(16.7%)延长(P<0.01)。在急性损伤实验中,999小儿感冒颗粒高剂量组能降低肺指数(P<0.05),减轻肺部病理变化,抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-6的水平(P<0.05,P<0.01),上调抑炎因子IL-10和IFN-γ水平(P<0.05,P<0.01)。此外,999小儿感冒颗粒对鼠肺中病毒血凝素效价以及脂质过氧化产物MDA具有一定的抑制作用,但差异无统计学意义。结论 999小儿感冒颗粒高剂量治疗组对流感病毒诱导的肺损伤有显著的保护作用,其作用机制与抗炎、免疫调控途径有关。 展开更多
关键词 小儿感冒颗粒 甲型流感 肺损伤 抗炎 抗病毒
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D-氨基酸氧化酶在毕赤酵母中的表达及快速纯化 被引量:2
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作者 冯美卿 史训龙 +2 位作者 孙传文 周伟 周珮 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期622-625,共4页
目的建立简便、快速纯化D-氨基酸氧化酶(DAAO)的新方法,以利用高纯度的DAAO转化头孢菌素C制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7ACA)。方法通过基因工程手段,构建N端和C端各镶嵌6个组氨酸的DAAO重组质粒,电转化Pichia pastoris GS115电感受... 目的建立简便、快速纯化D-氨基酸氧化酶(DAAO)的新方法,以利用高纯度的DAAO转化头孢菌素C制备戊二酰-7-氨基头孢霉烷酸(GL-7ACA)。方法通过基因工程手段,构建N端和C端各镶嵌6个组氨酸的DAAO重组质粒,电转化Pichia pastoris GS115电感受态细胞,利用PCR方法筛选阳性转化子,再经甲醇诱导筛选出高表达菌。结果高表达重组菌(PHD12)摇瓶发酵单位达到2 000 IU/L,发酵罐内达到22 500 IU/L。并利用Ni螯合型树脂对表达的DAAO经一步分离纯化,以60%的总收率获得纯化产物。纯化产物保持良好的转化CPC-Na活性。结论利用基因工程表达组氨酸标记蛋白,可简化基因工程的下游工序。 展开更多
关键词 D-氨基酸氧化酶 毕赤酵母 表达 快速纯化
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D-氨基酸氧化酶在巴斯德毕赤酵母中的表达研究 被引量:1
11
作者 冯美卿 史训龙 +2 位作者 于建 袁中一 周珮 《中国医药工业杂志》 CAS CSCD 北大核心 2004年第7期397-401,共5页
用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化。PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到250... 用分子生物学方法获得了D-氨基酸氧化酶(DAAO)的表达质粒(pPIC3.5k-DAAO),用其电转化巴斯德毕赤酵母GS115获得重组菌,经筛选获得高表达菌株PD27,并对其高密度培养和诱导条件进行了优化。PD27工程菌经250ml摇瓶发酵得到的DAAO活力达到2500~2600IU/L,在14L发酵罐中的表达水平优于其它表达系统。 展开更多
关键词 D-氨基酸氧化酶 巴斯德毕赤酵母 表达
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基因工程菌表达D-氨基酸氧化酶研究进展 被引量:1
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作者 冯美卿 蔡钦生 +1 位作者 史训龙 周珮 《工业微生物》 CAS CSCD 北大核心 2004年第1期52-55,共4页
用分子克隆手段获得D 氨基酸氧化酶基因后 ,对其在不同表达系统如大肠杆菌系统、酿酒酵母和克鲁维乳酸酵母、博伊丁假丝酵母。
关键词 基因工程菌 表达 D—氨基酸氧化酶 大肠杆菌系统、酿酒酵母 博伊丁假丝酵母 巴斯德毕赤氏酵母
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不同构建策略对D-氨基酸氧化酶表达的影响及发酵调节
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作者 冯美卿 史训龙 +2 位作者 黄海 张金晨 周珮 《复旦学报(医学版)》 CAS CSCD 北大核心 2008年第1期116-119,共4页
目的构建不含编码β-内酰胺酶编码基因的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)工程菌,对不同构建策略构建的重组菌进行发酵调节研究。方法采用分子生物学手段,利用不同的策略、不同的毕赤酵母宿主菌,构建DAAO工程菌;利用微生物发... 目的构建不含编码β-内酰胺酶编码基因的D-氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAAO)工程菌,对不同构建策略构建的重组菌进行发酵调节研究。方法采用分子生物学手段,利用不同的策略、不同的毕赤酵母宿主菌,构建DAAO工程菌;利用微生物发酵和调节手段,对工程菌的发酵条件进行优化。结果获得了表型不同的3株重组菌(Muts的PDK13和PDGA10,Mut+的PDG27),它们的最佳生长条件基本相似,诱导表达条件却不相同,在Basalsalts培养基内,当生长时间为36h,诱导培养基起始pH为6.0、甲醇浓度为0.5%时,最有利于DAAO表达。在菌体密度相同的条件下,Mut+表型(PDG27)甲醇代谢快,诱导24h,DAAO活力达到最高;Muts型(PDK13和PDGA10)甲醇代谢慢,诱导36h,DAAO活力达最高;通气量一定时,菌体密度增加,DAAO表达量增加,菌体增加到一定程度表达量反而下降,表明通气量应随菌体密度的增大而增加。结论Muts型重组菌对通气量要求低且更有利于高密度发酵。 展开更多
关键词 DAAO 重组菌表型 构建策略 表达 发酵调节
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十味龙胆花制剂及其组成药味对H1N1和H3N2流感病毒的体外抑制作用 被引量:1
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作者 付强 邱晓军 +4 位作者 辜艳红 史训龙 刘瑶琦 杨龙飞 洪峥 《临床合理用药杂志》 2020年第23期113-115,共3页
目的观察十味龙胆花制剂和10种组方药味对甲型猪流感病毒(H1N1)和甲型人流感病毒(H3N2)的体外抑制作用。方法采用细胞毒性MTT和体外抗病毒CPE法,以对MDCK细胞的毒性和对流感病毒的抑制率为评价指标,观察不同提取物对H3N2和H1N1的抑制作... 目的观察十味龙胆花制剂和10种组方药味对甲型猪流感病毒(H1N1)和甲型人流感病毒(H3N2)的体外抑制作用。方法采用细胞毒性MTT和体外抗病毒CPE法,以对MDCK细胞的毒性和对流感病毒的抑制率为评价指标,观察不同提取物对H3N2和H1N1的抑制作用。结果十味龙胆花制剂无论是水提物还是乙醇提取物,对H1N1和H3N2病毒均显示出抑制作用,其功效的发挥主要与烈香杜鹃、矮紫堇、龙胆花3种药材相关。结论十味龙胆花制剂抗流感病毒作用得到初步确认,但其药效成分和作用机制尚不清楚,值得深入研究。 展开更多
关键词 十味龙胆花制剂 组成药味 甲型猪流感病毒 甲型人流感病毒 体外抑制
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卫气营血传变规律与重症流感机体免疫功能的相关性及中药防治流感的策略 被引量:11
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作者 朱海燕 力弘 +1 位作者 史训龙 陈道峰 《中国中西医结合杂志》 CAS CSCD 北大核心 2017年第5期603-606,共4页
重症流感属中医学温病范畴,辨证以卫气营血辨证为纲。本文针对卫分证、气分证、营分血分证的病机与机体抗病毒的免疫调控的相关性进行了阐释,认为卫分、气分证候阶段,是免疫调控药物能有效发挥治疗流感作用的阶段。若将温病辨证与中药... 重症流感属中医学温病范畴,辨证以卫气营血辨证为纲。本文针对卫分证、气分证、营分血分证的病机与机体抗病毒的免疫调控的相关性进行了阐释,认为卫分、气分证候阶段,是免疫调控药物能有效发挥治疗流感作用的阶段。若将温病辨证与中药药理有机结合起来应用,既辨证,又辨明其免疫调节药理,对临床上中药的选择大有裨益,是中医药与现代医学结合的一种方式。 展开更多
关键词 卫气营血辨证 温病 重症流感 免疫调节
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Qiangzhi Decoction(羌跖汤) Protects Mice from Influenza A Pneumonia through Inhibition of Inflammatory Cytokine Storm 被引量:7
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作者 朱海燕 黄海 +5 位作者 史训龙 周伟 周珮 颜乾麟 朱宏光 鞠佃文 《Chinese Journal of Integrative Medicine》 SCIE CAS CSCD 2015年第5期376-383,共8页
Objective: To investigate the preventive effects of Qiangzhi Decoction (羌跖汤, QZD) on influenza A pneumonia through inhibition of inflammatory cytokine storm in vivo and in vitro. Methods: One hundred ICR mice w... Objective: To investigate the preventive effects of Qiangzhi Decoction (羌跖汤, QZD) on influenza A pneumonia through inhibition of inflammatory cytokine storm in vivo and in vitro. Methods: One hundred ICR mice were randomly divided into the virus control, the Tamiflu control and the QZD high-, medium-, and low-dose groups. Mice were infected intranasally with influenza virus (H1N1) at 10 median lethal dose (LDso). QZD and Tamiflu were administered intragastrically twice daily from day 0 to day 7 after infection. The virus control group was treated with distilled water alone under the same condition. The number of surviving mice was recorded daily for 14 days after viral infection. The histological damage and viral replication and the expression of inflammatory cytokines were monitored. Additionally, the suppression capacity on the secretion of regulated on activation normal T cells expressed and secreted (RANTES) and tumor necrosis factor-α (TNF-α ) in epithelial and macrophage cell-lines were evaluated. Results: Compared with the virus control group, the survival rate of the QZD groups significantly improved in a dose-dependent manner (P〈0.05), the viral titers in lung tissue was inhibited (P〈0.05), and the production of inflammatory cytokines interferon-γ (IFN- α ), interleukin-6 (IL-6), TNF-α, and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) were suppressed (P〈0.05). Meanwhile, the secretion of RANTETS and TNF-α by epithelial and macrophage cell-lines was inhibited with the treatment of QZD respectively in vitro (P〈0.05). Conclusions: The preventive effects of QZD on influenza virus infection might be due to its unique cytokine inhibition mechanism. QZD may have significant therapeutic potential in combination with antiviral drugs. 展开更多
关键词 herbal medicine influenza A virus antiviral activity PNEUMONIA inflammatory cytokine Chinesemedicine
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