敲除CRFK细胞氨基肽酶N对猫传染性腹膜炎病毒复制影响的研究

猫氨基肽酶N(fAPN)参与猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)的感染过程,为研究f APN对FIPV复制的影响,本研究针对f APN第14外显子设计了1对sg RNA,将sg RNA退火后克隆至p X458质粒中,构建同时含有Cas9蛋白和sg RNA的重组质粒。重组质粒经PCR及测序鉴定正确后,瞬时转染猫肾细胞(CRFK)中,24 h后通过流式细胞仪分选带有绿色荧光的单克隆细胞。单克隆细胞经稳定传代培养后,细胞中的绿色荧光消失,对细胞进行PCR和测序,结果显示:3株单克隆细胞在f APN第14外显子有1个碱基的插入,造成移码突变,导致f APN不能正常表达,表明敲除f APN蛋白的CRFK细胞系正确构建,命名为KO-APN14。将FIPV分别感染CRFK细胞及培养20代的KO-APN14细胞,48 h后通过间接免疫荧光试验(IFA)检测FIPV N蛋白的表达;将FIPV分别感染CRFK细胞及KO-APN14细胞,在感染4 h、12 h、24 h、36 h时采用RT-q PCR分别检测FIPV N基因、视黄酸(维甲酸)诱导基因I(RIG-I)、黑色素瘤分化相关基因5(MDA5)、Toll样受体3(TLR3)、干扰素β(IFN-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)的转录水平。IFA结果显示:感染FIPV的CRFK细胞出现绿色荧光,未感染FIPV的CRFK细胞、未感染FIPV的KO-APN14细胞及感染FIPV的KO-APN14细胞均无绿色荧光;RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后病毒N基因的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够极显著抑制FIPV N基因的转录(P<0.0001);RT-q PCR检测FIPV感染各细胞后上述各细胞因子的转录水平,结果显示:与感染FIPV的CRFK细胞相比,感染FIPV的KO-APN14细胞能够抑制RIG-I、MDA5、TLR3、IFN-β、IL-6、IL-10、TNF-α及f APN的转录。综上所述,f APN是FIPV在侵入细胞及病毒复制过程中发挥重要作用,并在FIPV引起的炎症反应过程中起关键作用。本研究为f APN在免疫炎症反应中作用的研究提供科学依据,并为培育基因编辑抗病育种猫奠定实验基础。

猪氨基肽酶N病毒结合受体核心区对TGEV在ST细胞中复制影响的研究

为研究与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)结合的猪氨基肽酶N(pAPN)受体核心区对TGEV复制以及细胞功能的影响,本研究检索并分析pAPN与TGEV的结合位点,结果显示,敲除pAPN aa668~aa963对其酶活性无影响。因此,利用CRISPR/Cas9技术构建pAPN与TGEV结合位点敲除细胞系,经PCR和western blot鉴定结果显示,正确构建一株敲除pAPN aa668~aa963的ST细胞系,即敲除pAPN 15-21外显子,命名为KO-ST-15。采用CCK-8和细胞划痕方法检测KO-ST-15细胞的增殖和细胞迁移活性,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子对ST细胞增殖和迁移活性均无显著影响。利用RT-qPCR和IFA检测KO-ST-15感染TGEV后病毒复制拷贝数和N蛋白的表达,结果显示,敲除pAPN 15-21外显子可极显著抑制TGEV在ST细胞系中的复制(P<0.001)。利用RT-qPCR检测KO-ST-15感染TGEV后炎症相关基因转录水平变化,结果显示,TGEV感染后KO-ST-15中的IL-6、IL-8和NLRP3(NOD-like receptor protein 3)mRNA转录水平无显著变化,但RIG-I和MDA5的转录水平显著上调(P<0.05)。上述结果首次表明,敲除pAPN15-21外显子能够极显著抑制TGEV在ST细胞中的复制,但细胞KO-ST-15的正常生理功能无变化,TGEV不能进入敲除pAPN 15-21外显子的细胞中引起炎症反应,该结果为进一步培育抗病育种猪提供参考依据和候选方案。

MDA5基因敲除小鼠的构建

MDA5作为RLRs蛋白家族成员,能特异性的识别较长的双链RNA,激活体内的信号通路,促进Ⅰ型干扰素的表达,在天然免疫系统中发挥着重要作用。本研究利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠MDA5基因第一外显子区域选择一段序列作为靶序列,将含有靶序列的sgRNA和Cas9质粒的体外转录产物显微注射至C57BL/6近交系小鼠的受精卵中,8只F0代首建鼠中5号小鼠为MDA5基因敲除纯合小鼠;将其与野生型(WT)小鼠合笼繁育出MDA5^(+/-)小鼠,再通过全同胞合笼交配的方式获得纯合子小鼠。基因组PCR后检测显示F2代小鼠中有4只纯合小鼠,进一步RT-PCR结果显示MDA5敲除小鼠各脏器中MDA5基因均未表达,表明基于CRISPR/Cas9技术的MDA5基因敲除小鼠模型构建成功。为进一步研究MDA5在天然免疫应答机制和抗病毒感染等方面提供有价值的模型。

TRIM30α^(-/-)小鼠模型的构建及其表型分析

TRIM30α作为TRIM蛋白家族成员,在天然免疫系统中发挥重要作用。为了研究TRIM30α基因的特性及功能,本研究在小鼠TRIM30α基因第一段编码区选择一段作为靶序列,合成了2条sgRNA,构建了重组质粒pUC19-TRIM30α-sgRNA1/2并体外转录后分别与体外转录并加poly(A)尾的pT7-SpCas9-SV40混合后经显微注射至C57BL/6近交系小鼠的受精卵中,获得第一代(F0代)TRIM30α基因敲除的小鼠并经PCR鉴定。将其与野生型(WT)小鼠合笼繁育出TRIM30α^(+/-)小鼠(F1代),经PCR鉴定后再通过全同胞交配的方式获得TRIM30α基因敲除的纯合子(TRIM30α^(-/-))小鼠(F2代)。通过PCR和测序在DNA水平鉴定TRIM30α^(-/-)小鼠各组织(心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉)TRIM30α基因的敲除情况;经RT-PCR检测TRIM30α^(-/-)小鼠上述各组织TRIM30α基因mRNA的转录水平;利用PCR分别扩增小鼠中的3个高频脱靶位点(Trim30d、D6WSu163e、Sbk1)后经T7E1酶切检测TRIM30α^(-/-)小鼠的脱靶效应。结果显示,分别获得了缺失了4 bp和7 bp片段的两种TRIM30α基因缺失的F0代小鼠(TRIM30α^(+/-)),选择缺失7 bp的TRIM30α^(+/-)小鼠繁育获得F1、F2代小鼠。PCR鉴定结果显示,共获得了7只TRIM30α^(-/-)纯合子小鼠;从DNA水平和mRNA转录水平鉴定结果显示,TRIM30α^(-/-)小鼠各组织的基因组DNA扩增条带均小于WT小鼠的扩增条带;且其体内未检测到TRIM30α基因的mRNA;TRIM30α^(-/-)小鼠体内也未检测到其他位点的脱靶编辑;TRIM30α^(-/-)小鼠的生长发育、血常规、血生化指标与WT小鼠相比均无显著差异。以上结果表明TRIM30α^(-/-)小鼠模型构建成功。本研究为探究DNA病毒介导的天然免疫应答中TRIM30α所发挥的作用提供了实验材料和研究依据。

MAVS^(-/-)细胞系的构建及其影响禽流感病毒复制的研究

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MAVS基因稳定敲除的细胞株,对流感病毒的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向MAVS基因sgRNA表达载体,与pCAG-Cas9-EGFP表达载体共转染MDCK细胞,经过流式细胞仪分选、PCR、基因测序筛选MAVS敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量PCR方法检测H9N2亚型禽流感病毒(AIV)感染后的TCID_(50)、病毒拷贝数以及IRF3、IFN-β、Mx1基因转录水平变化。结果显示,筛选出1株MAVS基因缺失44 bp的MDCK细胞(MAVS^(-/-)MDCK),其增殖速度与正常细胞相比未观察到显著差异;荧光定量PCR结果表明,TCID_(50)、病毒拷贝数差异最高可分别达到MDCK细胞的4.11倍和1.82倍;MAVS^(-/-)MDCK中IRF3、IFN-β和Mx1 m RNA表达水平显著降低,表明MAVS敲除后抑制了Ⅰ型干扰素信号通路。表明,本研究获得的MAVS^(-/-)MDCK能够促进禽流感病毒的复制,为提高疫苗生产效率和质量提供候选细胞株;该细胞株也为进一步研究MAVS参与抗病毒天然免疫应答奠定基础。