蓝点马鲛mstn克隆及表达分析

利用同源克隆和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了蓝点马鲛肌肉生长抑制素基因(mstn),并分析了mstn的结构特征和亲缘关系。克隆的蓝点马鲛mstn共3870 bp,包括3个外显子1131 bp和2个内含子1201 bp。外显子Ⅰ379 bp,内含子Ⅰ374 bp,外显子Ⅱ371 bp,内含子Ⅱ827 bp,外显子Ⅲ381 bp,5'UTR 108 bp,3'UTR 1430 bp。3'UTR含有加尾信号AATAAA。mstn共编码376个氨基酸包括信号肽(1 aa^22 aa)、TGF-β前肽区域(37 aa^257 aa)和TGF-β功能域(282 aa^376 aa)。在内含子Ⅱ和3'UTR发现微卫星序列,分别为(CA)_5和(CA)_(10)TG(CA)_6CT(CA)_(10)。蓝点马鲛MSTN具有脊椎动物MSTN的共同特征,含一个蛋白酶水解位点RARR和9个保守的半胱氨酸残基。脊椎动物MSTN氨基酸序列的亲缘关系分析发现,蓝点马鲛与鳜鱼亲缘关系最近与其他鲈形总目鱼类聚为一簇。以β-actin为内参基因,qPCR分析表明,蓝点马鲛mstn在二龄鱼不同组织表达情况不同,在鳃、肝和肾中表达较高,而在肌肉、肠、胃、脾和性腺中表达量较低。这些结果可为蓝点马鲛肌肉生长和发育的分子机制研究提供信息。

蓝点马鲛鱼内参基因的克隆及表达稳定性评价

合适内参基因的选择是实时荧光定量PCR技术准确测定目的基因表达量的前提。首先克隆了蓝点马鲛鱼3个内参基因β-actin、GAPDH和EF1-α的部分序列,并通过实时荧光定量PCR分析β-actin、GAPDH、EF1-α和18S rRNA 4个内参基因在蓝点马鲛鱼各组织中的Ct值,应用3种内参基因筛选软件(geNorm,Norm Finder和Bestkeeper)综合分析这4个基因的表达稳定性。结果表明最稳定的内参基因是EF1-α,其次是18S rRNA。研究结果为今后蓝点马鲛鱼合适内参基因的选择提供了依据。