伪狂犬病病毒免疫刺激复合物(ISCOM)的制备及其免疫效果检测

制备了伪狂犬病病毒囊膜蛋白免疫刺激复合物(ISCOM)。在电镜下呈典型笼状结构,直径约为40nm。其中抗原成分经SDS-PAGE电泳只出现一条带。用所制备的ISCOM10g为一头份免疫兔,中和抗体的最高效价为1:45,ELISA抗体效价最高可达1:128,两者均高于相同头份的亚单位疫苗、灭活疫苗及弱毒疫苗。ISCOM免疫兔后,攻击100LD50闽A株强毒,保护率为100%。

免疫刺激复合物(ISCOM)基质Quil A的纯化与测定

利用G 75凝胶从粗制皂素中制备出QuilA,并用紫外吸收法与溶血法对其含量进行测定,结果分别为49.6%和47.3%。

淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒GP2单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)单克隆抗体(m Ab)。方法采用杂交技术获得并筛选出杂交瘤细胞,收集含单克隆抗体的培养上清行免疫荧光(IFA)、dot-blot、ELISA法鉴定抗体重链类型和测定单克隆抗体的免疫效价。用蛋白G Sepharose亲和层析填料纯化抗体,纯化后的抗体采用SDS-PAGE检测纯化效果,并进一步用Western blot检查抗体对LCMV的作用部位。结果成功获得能稳定分泌抗LCMV的特异性杂交瘤细胞株,顺利获得纯化的单克隆抗体,命名为anti-GP2。免疫荧光、ELISA结果均证实获得的单克隆抗体能识别LCMV抗原。用ELISA法鉴定出该单克隆抗体重链类型为Ig G2b,培养液免疫效价大约为1.35×10~3。蛋白G Sepharose亲和层析填料纯化抗体后经SDS-PAGE检测证实纯化抗体成功。Western blot提示该单克隆抗体对LCMV的作用部位为病毒颗粒表面糖蛋白抗原GP2。结论成功制备出了针对LCMV病毒颗粒表面糖蛋白抗原GP2的单克隆抗体(anti-GP2 m Ab)。

肿瘤特异性CD8^(+)T细胞研究现状

CD8^(+)T细胞是介导抗原特异性免疫应答的主要细胞,其功能状态受到分子机制的精密调控,在肿瘤免疫中发挥关键作用。近年来,基于CD8^(+)T细胞杀伤功能的过继性细胞疗法(例如TCR-T和CAR-T细胞治疗)和阻断PD-1抑制性信号的免疫检测点疗法在肿瘤临床治疗中取得了前所未有的效果。但是这些免疫疗法对患者的治疗效果仍然有限,主要表现为免疫治疗抵抗,其中重要的机制是肿瘤抗原特异性CD8^(+)T细胞功能耗竭。因此,免疫治疗研究的热点和难点是探究肿瘤抗原特异性CD8^(+)T细胞功能耗竭的调控机制,并探索干预策略和靶点以增强CD8^(+)T细胞的效应功能,抵抗功能耗竭。本文分别从耗竭CD8^(+)T细胞的异质性、对PD-1 ICB的响应及表观遗传特征三个方面综述CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫应答的研究进展。

急性病毒感染条件下组蛋白甲基化转移酶EZH2对CD4^+T细胞mTOR信号通路的影响

目的探究在急性病毒感染条件下组蛋白甲基化转移酶EZH2对CD4^+T细胞mTOR信号通路的影响。方法运用淋巴细胞脑膜炎脉络丛病毒Armstrong病毒株对EZH2条件性诱导敲除小鼠进行感染,建立急性病毒感染模型。在不同时间点给与他莫昔芬处理,诱导EZH2敲除,然后采用流式细胞术检测小鼠脾脏CD4^+T细胞的频率和数量,以及mTOR通路和相关代谢指标的表达情况。结果 1)感染第8天,EZH2敲除组的CD44^+CD4^+T细胞的频率和数量与对照组相比都显著下降,mTORC1信号通路下游靶标S6,4E-BP1的磷酸化水平以及CD71,CD98的表达量显著下降,而mTORC2信号通路下游靶标Akt,FoxO1/3a的磷酸化水平显著升高。2)感染后第4～7天给予他莫昔芬处理诱导EZH2敲除,第8天检测他莫昔芬处理组CD44^+CD4^+T细胞的数量下降,但下降程度降低。S6及Akt磷酸化水平无统计学差异,p4E-BP1和CD71、CD98表达量降低,而pFoxO1/3a表达量上升。3)在感染后期第9～12天进行他莫昔芬处理的小鼠与对照组相比,其CD44^+CD4^+T细胞的数量和频率,以及mTORC1、mTORC2相关指标的表达量均没有统计学差异。结论在急性病毒感染条件下甲基化转移酶EZH2对CD4^+T细胞的免疫应答至关重要,同时对CD4^+T细胞的mTOR信号通路具有调控作用,并且这样的调控作用主要发生在感染早期。

低剂量雷帕霉素给药对流感病毒感染的小鼠肺组织常驻CD8^+记忆T细胞的影响

目的雷帕霉素(rapamycin)已被报道可以促进记忆性CD8^+T细胞,包括效应性记忆(effector memory)CD8^+T细胞及中央记忆性(central memory)CD8^+T细胞的分化,但是其对组织常驻(tissue resident)CD8^+记忆T细胞的调控作用尚未见报道。本研究旨在探索雷帕霉素对小鼠组织常驻CD8^+记忆T细胞的影响。方法将C57BL/6J野生型小鼠随机分成2组:对照组和雷帕霉素处理组。向其输注能够特异性识别LCMV抗原gp33-41的P14细胞(CD8^+T细胞),而后利用表达LCMV gp33-41的流感病毒感染小鼠。利用流式染色技术检测和比较2组小鼠在不同时间点的血液、淋巴结以及肺脏中抗原特异性CD8^+记忆T细胞的比例和数量以及相应的表面分子、胞内细胞因子。结果与对照组相比,雷帕霉素处理组的外周血、引流淋巴结以及肺组织内的抗原特异性CD8^+记忆T细胞均显著增多,同时发现外周血中CD8^+记忆前体细胞比例增多,淋巴结中的中央型CD8^+记忆T细胞比例及数量增多、CD8^+记忆T细胞的功能增强,肺脏组织常驻CD8^+记忆T细胞的CD103和CD69的表达上升。结论感染流感病毒后,持续低剂量给予雷帕霉素能够抑制mTOR信号从而提高组织特异性常驻CD8^+记忆细胞的形成和维持,这为新型流感疫苗的研发提供了新的思路。

激酶mTORC2在EAE模型中对致病性CD4^(+)T细胞的调控作用

目的研究mTORC2信号缺陷减轻EAE临床症状和其对致病性CD4^(+)T细胞的调控机制。方法通过MOG35-55肽免疫分别诱导Rictor^(fl/fl)CD4cre(Rictor^(-/-))和Rictor^(fl/fl)(WT)小鼠,记录其临床症状分数和体质量变化情况,应用流式细胞术检测致病性CD4^(+)T细胞亚群的数目、过氧化脂质水平和线粒体来源的ROS水平。结果Rictor^(-/-)小鼠中EAE临床症状比WT小鼠更轻,致病性CD4^(+)T细胞更少,且这群细胞更易发生铁死亡。结论mTORC2信号缺陷通过促使致病性CD4^(+)T细胞发生铁死亡来减轻EAE的临床症状。

Rictor/mTORC2在CD8^(+)T细胞抗肿瘤免疫应答中的作用

目的探讨Rictor/mTOR复合物2(mTORC2)在小鼠CD8^(+)T细胞抗肿瘤生长和转移免疫应答中的作用。方法用Rictor^(fl/fl)CD4-Cre小鼠(Rictor^(-/-))和C57BL/6J小鼠(WT)构建MC-38皮下肿瘤模型和B16-F10肺转移模型,观察小鼠肿瘤生长情况;清除CD4^(+)T细胞后,观察Rictor敲除(Rictor^(fl/fl)ERT2-Cre小鼠他莫昔芬诱导)对小鼠抑制MC-38肿瘤生长的影响,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中浸润的淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)应答情况、肿瘤反应性CD8^(+)TILs分泌细胞因子(IFNγ、CD107、GzmB、IL-2)、增殖(Ki-67)、凋亡(Bcl-2、AnnexinⅤ)的变化以及WT小鼠在MC-38肿瘤进展过程中mTORC2信号(Akt和FoxO1/3a)的活化情况。结果Rictor^(-/-)小鼠MC-38实体瘤和B16-F10肺转移的肿瘤负荷比WT小鼠下降,CD4^(+)T细胞清除后Rictor敲除小鼠MC-38肿瘤体积仍然减小,肿瘤反应性CD8^(+)TILs比例升高;肺转移模型中Rictor^(-/-)小鼠效应CD8^(+)TILs也较WT小鼠增多,而效应CD4^(+)T细胞无显著差异;Rictor敲除后肿瘤反应性CD8^(+)TILs表达细胞因子(IFN-γ、GzmB、IL-2)水平升高,增殖和凋亡水平无显著改变;在WT小鼠中,MC-38肿瘤组织中CD8^(+)TILs持续上调表达Akt和FoxO1/3a。结论CD8^(+)T细胞中Rictor/mTORC2的抑制促进肿瘤反应性CD8^(+)TILs的分化,增强其效应功能,提高的小鼠抗肿瘤生长能力。

Mettl3对滤泡调节性T细胞免疫应答的调控研究

目的探讨Mettl3对滤泡调节性T细胞(T_(FR),follicular regulatory T cells)免疫应答的调控作用。方法用LCMVArmstrong病毒感染Mettl3的条件性敲除组Mettl3^(fl/fl)Cd4-Cre/Mettl3^(fl/fl)Cxcr5-Cre小鼠以及对照组WT小鼠。在感染后第8天,利用流式细胞术检测Mettl3敲除组小鼠和对照组WT小鼠脾脏T_(FR)细胞的频率、数量和T_(FR)细胞功能相关标志物(PD1、GITR、ICOS)的表达,生发中心(germinal center,GC)B细胞和浆细胞的数量和频率。通过1:1过继转移WT小鼠和Mettl3^(fl/fl)Cd4-Cre小鼠来源的骨髓细胞,构建骨髓嵌合小鼠,8周后选择重建成功的小鼠注射NP-OVA/CFA进行蛋白免疫,第8天时,利用流式细胞术检测小鼠脾脏中2种来源T_(FR)细胞的频率和T_(FR)功能相关分子(CTLA4、GITR)的表达。结果LCMV-Armstrong感染后,与WT组相比,Mettl3^(fl/fl)Cd4-Cre和Mettl3^(fl/fl)Cxcr5-Cre小鼠T_(FR)细胞的频率和数量减少(P<0.05),T_(FR)细胞PD1、GITR、ICOS的表达下降(P<0.05),GC-B细胞和浆细胞的数量和频率降低(P<0.05)。NP-OVA蛋白免疫后,骨髓嵌合小鼠中敲除Mettl3的T_(FR)细胞比例降低,CTLA4、GITR的表达下降(P<0.05)。结论Mettl3的缺失抑制了急性感染和蛋白免疫应答中T_(FR)细胞的分化和功能。

肿瘤引流淋巴结抗原特异性记忆CD8^(+)T细胞是PD-1/PD-L1免疫检查点阻断治疗的关键响应者

CD8^(+)T细胞耗竭是机体免疫系统不能有效清除慢性病毒感染及恶性肿瘤的关键原因.相较于急性感染或者疫苗免疫情形下诱导形成的记忆性CD8^(+)T细胞,耗竭的CD8^(+)T细胞表面持续表达包括PD-1在内的免疫检查点分子,其增殖潜力、效应及杀伤功能等都较为低下,且易于凋亡.