平颏海蛇碱性磷脂酶A_2的融合表达、纯化及活性特征

将编码平颏海蛇碱性磷脂酶A2 的基因 (PLA2 9)克隆于硫氧还蛋白基因融合表达载体pPETTRX的trxA基因的 3′末端 ,构建符合读码框的融合基因 .2 5℃下经IPTG诱导 ,该融合蛋白在大肠杆菌中以可溶形式表达 ,表达量达 2 0 %以上 .利用金属螯合亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化 ,得到纯度 85%的融合蛋白 .经肠激酶切割和离子交换柱层析进一步纯化后 ,得到浓度 95%以上的成熟PLA2 9.对重组PLA2 9进行了Western印迹检测 .重组PLA2 9具有与天然PLA2 相近的酶活性 ;并具有对HL60等几种肿瘤细胞的细胞毒作用 ,这在海蛇PLA2 中是首次报道 .平颏海蛇碱性PLA2 融合表达及快速纯化系统的建立 。

微生物基因组的生物信息学研究平台的建立

随着人类基因组计划及其它测序工作顺利进行,人们已经得到了大量的基因序列。如何阐明这些序列的功能和意义,是功能基因组学的主要任务。生物信息学和比较基因组学为加速这一进程提供了有利的工具。该研究建立了对已经完成全基因组测序和部分测序的25种细菌的基因组的生物信息学研究平台,提供了WEB形式的服务(http://202.116.74.108)。25种细菌的全基因组蛋白质序列可以在NCBI的ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/geabank/genomes/bacteria下载。该系统可以按照基因序列号、功能和种属名查询基因序列,根据美国国家信息中心(NCBI)的功能代码表对每个基因进行了自动和手工分类,并可查询分类情况,在此基础上建立了几种亲缘关系相近的种属的同源基因相互注释功能的应用。

基于unix的cDNA序列自动分析系统的构建和应用

基于unix/linux操作系统和mysql数据库 ,利用phred/phrap ,stackpack ,blast软件 ,对cDNA和EST序列进行大规模自动分析。它可以完成从测序峰图文件向核酸序列的转化 ,去除载体污染和重复序列 ,序列聚类 ,拼接 ,分析可变剪切 ,数据库搜索进行相似性分析。该系统可以加速大规模EST测序的分析速度。

平颏海蛇PLA_2在大肠杆菌中的融合表达

将编码平颏海蛇磷脂酶A2 的基因 (PLA2 9)分别克隆于硫氧环蛋白基因融合表达载体pThioHisC和pTRX的HP trxA和trxA基因的 3′末端 ,构建符合读码框的融合表达载体pThioHisC PLA2 和pTRX PLA2 。 2 5℃下经IPTG诱导 ,PLA2 融合蛋白在两种原核系统中均能获得较高表达 ,但PLA2 在pTRX系统下的表达量和蛋白溶解性优于pThioHisC系统。将两种系统下的表达产物进行金属螯合亲和层析纯化 ,Trx PLA2 融合蛋白的纯度可达 85 %以上 ,而HP Trx PLA2 不表现出对介质的亲和性 ,难以得到纯化。由此 ,将pTRX PLA2 载体系统确立为进一步大量表达和纯化的载体系统。