基于实时无标记细胞分析技术时间维度特征的体外抗肿瘤活性评价新策略

目的基于实时无标记细胞分析(real time cellular analysis,RTCA)技术,以黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷和顺铂为例进行抗A549、H1299肺腺癌活性分析,建立一种反映时间维度变化特征的EC_(50)评价新策略。方法应用RTCA Software Pro数据分析及GraphPad Prism、Origin Pro做图,分别采用终点法和时间维度表征黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷、顺铂受试液/药的体外抗A549、H1299肺腺癌活性。结果①受试液/药对A549及H1299细胞在24 h、48 h终点法中的EC_(50)值有的存在较大差异。②采用四参数方程拟合曲线的相关系数>0.9,EC_(50)动态变化相对稳定期(相邻4点EC_(50)线性拟合|斜率|≤1)计算此时间维度内的EC_(50)值。黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷和顺铂对A549细胞的EC_(50)分别为52.97±1.75μmol·L^(-1)(16~48 h)、62.88±2.91μmol·L^(-1)(32.25~48 h)、78.84±0.33μmol·L^(-1)(21.5~29.75 h)、13.57±1.54μmol·L^(-1)(27.5~48 h);黄芩苷、黄芪甲苷、橙皮苷和顺铂对H1299细胞的EC_(50)分别为43.71±1.26μmol·L^(-1)(19.5~48 h)、47.23±1.19μmol·L^(-1)(14~48 h)、39.45±0.24μmol·L^(-1)(12.75~46.25 h)、25.97±4.76μmol·L^(-1)(10.25~48 h)。显示受试液/药抗肿瘤起效的时间窗口期不同。结论基于RTCA技术,选用拟合度好、稳定并带有时间维度特征的EC_(50)数据用于抗肿瘤活性评价将更加精确和合理。此外,这种区分开不同有效时间的抗肿瘤药物方法可为临床联合用药的给药时机提供参考,本思路也将为其他体外相关研究提供借鉴。

6种中成药对SARS-CoV-23CLpro和PLP活性的抑制作用

目的研究治疗新型冠状病毒肺炎不同时期的6种中成药对3C样蛋白酶(3CLpro)和木瓜样蛋白酶(PLP)的抑制作用,探讨其干预新型冠状病毒肺炎的机制。方法经镍柱纯化获得原核表达且纯度高的3CLpro和PLP。基于荧光共振能量转移原理,建立3CLpro和PLP活性检测的药物筛选模型,分别以3CLpro抑制剂依布硒、PLP抑制剂GRL0617验证筛选模型的有效性。在此基础上,开展针对新型冠状病毒肺炎临床不同时期(医学观察期、轻型、普通型、重型、危重型)的代表性6种中成药靶向抑制3CLpro和PLP活性的研究。结果金花清感颗粒、疏风解毒胶囊、热毒宁注射液、血必净注射液、痰热清注射液对3CLpro具有较强的抑制作用(抑制率>80%),同时疏风解毒胶囊、痰热清注射液、热毒宁注射液对PLP也具有较强的抑制作用(抑制率>80%)。结论金花清感颗粒等6种中成药对3CLpro或PLP都有较强的抑制作用,这可能是它们针对新型冠状病毒肺炎临床不同时期发挥抗SARS-CoV-2的内在机制。另外,疏风解毒胶囊、痰热清注射液、热毒宁注射液对新型冠状病毒2个靶蛋白酶活性的抑制作用都较强,可能具有潜在抗病毒活性。

基于实时体温监测技术探讨酵母菌、脂多糖、2,4-二硝基酚对小鼠致热作用及呼吸功能的影响

目的基于实时体温监测技术比较酵母菌、脂多糖(LPS)、2,4-二硝基酚对小鼠致热作用及呼吸功能的影响。方法SPF级C57BL/6J雌性小鼠12只,进行动物核心体温监测胶囊腹腔埋入,将小鼠按体重、体温随机分为空白对照组、酵母菌组、LPS组、2,4-二硝基酚组。小鼠分别注射相应发热介质后,每天记录动物的体重,动物核心体温监测胶囊的记录频率为:每次15 min。3 d后对小鼠进行无创呼吸监测,分别测定特殊气道阻力(sRaw)、潮气量(TV)、呼吸频率(F)和气道传导率(sGaw)。实验结束后对小鼠进行解剖,取其胸腺、脾、肺进行称重并计算脏器指数。结果实验过程中,空白对照组小鼠体重持续上升,酵母菌组、2,4-二硝基酚组小鼠体重持续下降,LPS组小鼠48 h内体重升高,48 h后体重下降。酵母菌组脾指数对比空白对照组极显著升高(P<0.01),酵母菌组、2,4-二硝基酚组的胸腺指数对比空白对照组显著降低(P<0.05)。酵母菌组小鼠体温在注射后3 h开始升高,在48 h内持续处于高温水平,在24~48 h期间体温达到最大值,与空白对照组比,差异具有极显著性(P<0.01);48~72 h期间,酵母菌组小鼠体温开始逐渐下降,与空白对照组之间差异无显著性(P>0.05)。LPS组小鼠体温在注射后4 h开始升高,高温状态维持至8 h后开始降低,但仍高于空白对照组。无创呼吸监测发现,酵母菌组、LPS组、2,4-二硝基酚组sRaw均出现升高,TV、F、sGaw均出现降低。结论从发热时长比较,酵母菌作为发热介质引起发热时间最久,其次为LPS、2,4-二硝基酚;以发热趋势比较,酵母菌表现出先降后升的状态,于注射10 h达到峰值状态,LPS表现为持续升温,于注射4 h达到峰值状态,2,4-二硝基酚表现为先降后升,于注射8 h达到峰值状态;从呼吸功能比较,小鼠注射发热介质后,均出现气道阻力增强、抑制呼吸频率、降低潮气量、气道传导减弱情况,其中对比3种发热介质对小鼠呼吸影响,酵母菌对小鼠呼吸频率、潮气量、气道阻力、气道传导作用较强。因此,酵母菌无论是发热时长、发热高峰以及对机体呼吸功能抑制作用都更显著。

论我国刑罚的人文化选择——从社区矫正制度谈起

在西方刑罚轻刑化和人性化的趋势下,与传统刑罚相对的社区矫正非监禁性的刑罚执行活动,具有深刻的思想渊源和价值理念基础,我国的社区矫正制度的确立说明了我国刑罚的人文化选择,经过几年的社区矫正试点工作和立法上的确立,使得我国的社区矫正制度也取得了显著的成效。但是社区矫正制度作为我国刑罚中的新事物,其实施过程中必然会遇到一些阻碍和问题。通过明确立法,积极广泛宣传,提高群众对社区矫正的认知度,打消顾虑,发展经济,改善社区人文环境,广泛招募社会志愿者,完善培训教育机制等建立健全我国社区矫正制度。

磷酸奥司他韦不同时序干预对A型H1N1流感病毒感染小鼠模型药效及炎症因子调控作用研究

目的针对目前抗病毒体内实验给药时间点偏早的现状,本研究以磷酸奥司他韦(达菲)作为“工具药”,比较不同时序干预对病毒感染小鼠的影响,为抗病毒药物研究选择合理的模型干预时间点提供依据。方法将Balb/c小鼠随机分成6组,滴鼻感染流感病毒(0.25 TCID_(50))建立病毒感染小鼠模型,达菲-1组、达菲-2组分别在染毒后d 1和d 4灌胃给药。测定体质量,计算生存率、脏器指数,测定病毒载量及炎症因子含量。结果与空白对照组比较,模型组小鼠的体质量降低,肺指数均明显升高(P<0.05);模型-2组13个炎症因子表达水平差异有显著性(P<0.05)。与模型-1组相比,达菲-1组肺指数、脾指数明显降低(P<0.05),病毒载量为模型-1组的0.54倍;与模型-2组相比,达菲-2组肺指数明显降低(P<0.05)、胸腺指数明显升高(P<0.05),病毒载量为模型-2组的0.03倍,13个炎症因子表达水平差异具有显著性(P<0.05)。结论方案2的小鼠染毒后症状更明显、稳定、给药后减轻了肺部炎症损伤,考虑了潜伏期,待模型动物出现症状开始进行药物干预符合临床用药指征,无论是在模型评估还是药物评价将更合理和准确。

Mina53与CBX8在肝细胞肝癌中的表达及其与临床病理特征和预后的关系

目的探讨Mina53与CBX8在肝细胞肝癌中的表达,并分析两者与肝细胞肝癌患者临床病理特征及预后的关系。方法收集121例肝细胞肝癌患者术后切除标本制作组织芯片,采用免疫组织化学PV6000法检测Mina53与CBX8在肝细胞肝癌及相应癌旁相对正常组织中的表达,应用SPSS23.0软件对数据进行统计分析。结果Mina53、CBX8在肝细胞肝癌中的表达水平高于癌旁相对正常组织(均P<0.001)。Mina53表达与肿瘤大小、被膜侵犯、脉管侵犯、病理分级、TNM分期有关(均P<0.05);CBX8表达与乙肝表面抗原(HBsAg)、肿瘤大小、被膜侵犯、TNM分期有关(均P<0.05)。肝细胞肝癌中Mina53与CBX8表达呈正相关(r=0.574,P<0.01)。Mina53与CBX8均高表达患者的OS和DFS较Mina53或CBX8高表达者和两者均低表达者更短(均P<0.001)。多因素分析显示,Mina53、CBX8的表达水平是肝细胞肝癌患者术后OS和DFS的独立预后影响因素(P<0 . 0 5 ) 。结论 Mina53及CBX8在肝细胞肝癌组织中高表达, 可能与肝细胞肝癌的发生发展和浸润转移有关,Mina53和CBX8高表达提示患者预后不良,联合检测Mina53和CBX8有助于肝细胞肝癌的预后判断。

EIF5A2在人肝细胞癌中的表达及其与术后生存期的关系

目的检测真核翻译起始因子5A2(EIF5A2)在肝细胞癌(HCC)中的表达,探讨其与临床病理特征及预后的关系。方法qRT-PCR和Western blot法分别检测12对新鲜HCC及癌旁非瘤组织中EIF5A2 mRNA和蛋白水平的表达;免疫组织化学检测284对HCC及癌旁非瘤组织中EIF5A2的表达水平,并分析其与患者临床病理特征及预后的关系。结果新鲜HCC组织中EIF5A2 mRNA和蛋白质的相对表达水平均高于癌旁非瘤组织,差异有统计学意义(t=5.305,P=0.0003;t=10.120,P<0.001);284例HCC组织中EIF5A2的相对表达水平高于癌旁非瘤组织(z=-12.186,P<0.001)。EIF5A2的表达与HCC患者的肿瘤大小(χ^(2)=13.079,P<0.001)、肿瘤多发性(χ^(2)=4.589,P=0.032)和分化程度有关(χ^(2)=4.844,P=0.028);EIF5A2高表达患者术后三年及五年总体生存期及无病生存期较低表达者更短(均P<0.001);EIF5A2是影响HCC患者三年及五年总体生存期和无病生存期的独立预后因素(均P<0.05)。结论EIF5A2的高表达可能与肝细胞癌的发生发展有关,EIF5A2高表达是预后不良的独立影响因素,可作为判断肝细胞癌患者预后的潜在分子标志物。

肝细胞肝癌中Piwil2表达与临床病理特征及预后的关系

目的探讨肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中Piwil2的表达及其与HCC的发生与演进、临床病理特征、预后的关系。方法利用组织芯片技术和免疫组化PV 6000法检测163例HCC组织及对应癌旁非瘤组织中Piwil2的表达,并进行统计学分析。结果HCC组织中Piwil2的高表达率为47.85%(78/163),而癌旁非瘤组织中未发现高表达病例,两者差异有统计学意义(χ^2=102.532,P<0.001)。Piwil2表达与HCC病理分级、TNM分期、包膜侵犯、脉管侵犯均有关(P均<0.05),病理分级Ⅲ+Ⅳ级、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的患者高表达率高于Ⅰ+Ⅱ级、Ⅰ+Ⅱ期的患者(73.33%vs 26.14%,P<0.001;68%vs 44.2%,P=0.028)。Kaplan-Meier预后生存分析结果显示,Piwil2高表达组患者的总生存期和无瘤生存期较低表达组短(P均<0.05);有包膜侵犯、有脉管侵犯、病理分级Ⅲ+Ⅳ级、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期的患者Piwil2高表达组总生存期和无瘤生存期比低表达组短(P均<0.05)。Cox回归分析结果发现,Piwil2表达、TNM分期是影响HCC患者术后无瘤生存期和总生存期的独立影响因素(P<0.05)。结论Piwil2可能参与HCC的发生、发展,其高表达可促使癌细胞增殖与转移,并可影响患者术后生存时间。检测Piwil2在HCC中的表达具有重要的临床价值,并有望成为HCC治疗的新靶标。

探讨不同浓度Matrigel对小鼠Lewis肺癌异位皮下移植瘤的影响

目的探讨不同浓度Matrigel对小鼠Lewis肺癌异位皮下移植瘤的影响。方法将24只C57BL/6J Nifdc小鼠随机分为肺癌组、50%基质胶组、75%基质胶组、100%基质胶组,每组各6只。将Lewis肺癌细胞(LL/2)分别与0%、50%、75%、100%Matrigel按照体积1∶1混合,于小鼠右侧前肢腋下进行皮下注射,每日测量各组小鼠体重、饮食量及饮水量;观察比较各组成瘤时间、成瘤率和肿瘤大小,于肿瘤形成后每天测量肿瘤的长径、短径,计算肿瘤体积变化;于肿瘤接种第15天处死动物,完整剥离肿瘤组织并称重,HE染色检测肿瘤组织病变情况。结果与肺癌组相比,75%基质胶组小鼠自造模第2天起体重显著升高(P<0.05或P<0.01);100%基质胶组小鼠自造模第10天起,体重明显上升(P<0.05或P<0.01)。各组小鼠平均饮食量于造模8 d后有所降低,饮水量总体呈现上升趋势。各组小鼠成瘤率均为100%,添加基质胶组的小鼠相比肺癌组小鼠成瘤时间早,肿瘤生长速度快,且肿瘤较大。其中,75%基质胶组肿瘤体积增长最快,肿瘤重量最大,为(1358.88±388.14)mg,与肿瘤组相比,具有显著性差异(P<0.05);100%基质胶组肿瘤体积增长次之,肿瘤重量为(1142.37±423.08)mg,与肿瘤组相比,具有显著性差异(P<0.05);50%基质胶组肿瘤体积增长最慢,肿瘤重量最小,为(808.83±393.41)mg。HE染色结果显示,相比于肺癌组,添加基质胶组的肿瘤细胞生长旺盛、轮廓清晰、细胞核体积较大,肿瘤组织间质中血管成分明显增多。结论基质胶能稳定成瘤率,加快肿瘤生长,增大成瘤体积,且75%基质胶浓度条件下肿瘤增长最快、肿瘤体积最大,肿瘤的均一性较好。

水溶性聚苯胺纳米线的合成及性能研究

水溶性聚苯胺虽然解决了传统聚苯胺材料难溶难加工的问题,但是目前所用的合成方法导致材料的导电性能降低,从而限制其在诸多领域的应用。以硝酸铁为氧化剂,采用无模板法先合成了聚苯胺纳米线,然后以酸性磷酸酯为掺杂剂合成了水溶性聚苯胺纳米线。该纳米线不仅在水中分散得更加均匀,而且在提高聚苯胺水溶性的同时,保持了聚苯胺较高的导电性能,其结晶性能也有所改善。

金贝口服液抗SARS-CoV-2的作用机制研究

目的探讨金贝口服液(黄芪、党参、北沙参等组成)抗新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的作用机制。方法通过细胞病变效应和蚀斑实验证明金贝口服液对SARS-CoV-2的抑制作用;利用前期建立的基于3C样蛋白酶(3-chymotrypsin-like protease,3CLpro)和木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLP)活性的药物筛选体系,测定金贝口服液对3CLpro和PLP活性的抑制效果;利用超高效液相色谱测定金贝口服液中的主要成分,并将鉴定出的成分与3CLpro和PLP进行分子对接,推测金贝口服液中可能抑制SARS-CoV-2的物质基础。结果金贝口服液在体外具有抑制SARS-CoV-2作用,对3CLpro和PLP的IC50分别为(2.757±0.082)μL·mL^(-1)和(3.527±0.188)μL·mL^(-1)。分子对接结果显示,超高效液相色谱鉴定出的金贝口服液中12个主要成分中的连翘酯苷A、黄芩苷、丹酚酸B、汉黄芩苷、汉黄芩素、新绿原酸、隐绿原酸、异绿原酸B与3CLpro和PLP均有较好的结合能力,可能是金贝口服液中抑制SARS-CoV-2的物质基础。结论金贝口服液可能通过抑制3CLpro和PLP活性发挥抗SARS-CoV-2的作用,为其在新型冠状病毒感染治疗中的合理应用提供了依据和参考。

Myc诱导的核抗原53在肝细胞肝癌中的表达意义及其与患者预后的关系

目的检测Myc诱导的核抗原53(Mina53)在肝细胞肝癌(HCC)及距肿瘤边缘>5 cm的肝组织(LTM5)中的表达,并分析其与肿瘤发生、临床病理特征及患者生存预后的关系。方法用实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)分别检测18对新鲜HCC及LTM5中Mina53 mRNA和蛋白质的表达水平;用免疫组织化学方法检测Mina53在284份HCC及LTM5标本中的表达。计量资料组间比较采用配对样本t检验,方差不齐的数据采用Wilcoxon秩和检验;计数资料组间比较采用χ^2检验;Kaplan-Meier法、Log-Rank检验进行生存分析;Cox回归模型进行单因素、多因素分析。结果18对新鲜HCC组织中Mina53 mRNA和蛋白质的相对表达水平均明显高于其LTM5组织(mRNA:-4.41±1.48与-5.93±1.65,t=3.100,P=0.007;蛋白质:1.12±0.29与0.46±0.21,t=10.616,P<0.001);Mina53在284份HCC组织中的相对表达水平高于LTM5(z=-18.739,P<0.001)。Mina53的表达水平与肿瘤大小(χ^2=5.474,P=0.019)、脉管侵犯(χ^2=8.965,P=0.003)、病理分级(χ^2=12.006,P=0.002)、TNM分期(χ^2=16.686,P<0.001)有关;Mina53高表达HCC患者的术后总体生存时间和无病生存时间(分别为28.5个月、22.7个月)较低表达者(33.0个月、31.8个月)更短(P值均<0.05);Cox多因素回归分析表明,Mina53及肿瘤多发性是影响HCC患者术后总体生存时间和无病生存时间的独立预后因素(P值均<0.05)。结论Mina53可能在HCC发生中起重要作用,并参与肿瘤生长及浸润转移过程;Mina53高表达提示患者预后不良,可作为判断HCC患者预后的潜在标志物。

不同月龄BALB/c小鼠感染甲型H1N1型流感病毒的炎性调控差异研究

为对比不同月龄BALB/c小鼠感染甲型H1N1型流感病毒后的淋巴细胞相对含量和炎症因子调控差异,提供流感类病毒性疾病防控的基础研究证据,本研究选用2月、8月龄雌性BALB/c小鼠,分别感染1×10^(5)TCID_(50)/0.1mL的甲型H1N1型流感病毒PR8毒株,每天记录体重、肛温变化,于感染第7d处死解剖取材,计算脏器指数,qPCR技术检测肺组织流感病毒M基因拷贝数,流式细胞术检测全血CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)淋巴细胞含量及肺组织中IL-6、IFN-γ、MCP-1等炎症因子的分泌水平。结果显示:(1)感染相同剂量病毒7d后,2月龄小鼠有1例样本死亡,生存质量下降较大,8月龄小鼠全部存活,体重较第0d相比仅下降12.35%,感染后2月龄组小鼠胸腺指数明显下降(P<0.01),8月龄组变化不明显。(2)2月龄组染毒小鼠肺组织M基因拷贝数显著低于8月龄染毒组(P<0.05)。(3)染毒后,2月龄组小鼠体内IFN-γ、IFN-β、IL-6等促炎性细胞因子含量增长显著(P<0.05),IL-6、MCP-1、IL-23含量显著高于8月龄组(P<0.05);2月龄染毒组小鼠杀伤性T淋巴细胞CD8+相对比例也明显高于8月龄染毒组(P<0.05)。可推测2月龄小鼠在感染病原体后产生了较强的免疫反应以清除病毒,但免疫系统的过度反应导致体内IL-6等炎症因子大量分泌,可能出现了细胞因子风暴现象致使机体损伤严重,使2月龄实验组小鼠较8月龄相比出现了更差的状态与较高的死亡率。本研究提示低年龄段人群感染相同剂量的流感病毒时较高年龄段人群可能会出现更严重的病理损伤。