大黄素联合5AzA-cdR增强对胰腺癌细胞ppENK抑癌基因的去甲基化作用研究

目的 研究大黄素联合5-氮-2’脱氧胞苷(5AzA-cdR)能否增强其对胰腺癌细胞抑癌基因前脑啡肽原(ppENK)的去甲基化作用。方法 选择Panc1细胞为研究对象,首先采用细胞计数实验(CCK-8)检测不同浓度大黄素对胰腺癌细胞的生长抑制情况,根据CCK-8结果选择最适大黄素用药的浓度,后将Panc1细胞分为四组:对照组、最适大黄素浓度组、5AzA-cdR组和大黄素联合5AzA-cdR用药组,采用斑点杂交实验(Dot-blot)检测四组对基因组5-甲基胞嘧啶(5mc)的影响,最后使用重亚硫酸盐测序PCR(BSP)检测四组对ppENK甲基化的影响。结果CCK-8显示,大黄素以浓度梯度和时间梯度抑制Panc1细胞生长;Dot-blot结果显示,最适大黄素浓度组和5AzAcdR组5 mc水平低于对照组,差异均有统计学意义(t分别=12.55、20.12,P均<0.05),5AzA-cdR组5 mc较最适大黄素浓度组下降明显,差异有统计学意义(t=17.76,P<0.05),大黄素联合5AzA-cdR用药组5 mc较对照组、最适大黄素浓度组以及5AzA-cdR组显著下降,差异有统计学意义(t分别=30.22、20.77、10.45,P均<0.05)。BSP结果显示,最适大黄素浓度组和5AzA-cdR组ppENK甲基化水平均低于对照组,差异均有统计学意义(t分别=14.27、21.34,P均<0.05),5AzA-cdR组ppENK甲基化水平较最适大黄素浓度组下降明显,差异有统计学意义(t=16.41,P<0.05),大黄素联合5AzA-cdR用药组ppENK甲基化水平较对照组、最适大黄素浓度组以及5AzA-cdR组显著下降,差异均有统计学意义(t分别=32.68、19.33、10.12,P均<0.05)。结论 大黄素联合5AzA-cdR可增加其对胰腺癌细胞抑癌基因ppENK的去甲基化作用。

大黄素通过减少DNMTs的表达对胰腺癌细胞抑癌基因ppENK发挥去甲基化作用研究

目的研究大黄素对胰腺癌细胞Panc1 DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的影响,及其对抑癌基因前脑啡肽原(pre-proenkephalin,ppENK)启动子区CpG岛的去甲基化作用,探讨大黄素是否可通过降低DNMTs的表达逆转ppENK的甲基化状态。方法CCK-8检测不同浓度大黄素对Panc1细胞生长的影响,探索最佳用药浓度,重亚硫酸盐测序PCR(bisulfite genomic sequencing PCR,BSP)检测不同浓度大黄素对ppENK基因甲基化状态的影响,PCR和Western Blot检测ppENK及甲基转移酶DNMT1、DNMT3a的mRNA和蛋白表达情况。结果大黄素以时间梯度和浓度梯度依赖性抑制Panc1细胞生长,其半数最大抑制浓渡(half maximal inhibitory concentration,IC50)约为40μmol/L,大黄素可使ppENK甲基化状态减弱,非甲基化状态增强;可减弱DNMTs的mRNA和蛋白表达,增强ppENK mRNA和蛋白表达。结论大黄素可不同程度地使Panc1 ppENK抑癌基因去甲基化,使抑癌基因重新表达。大黄素抑制胰腺癌细胞生长和其去甲基化作用有关,推测大黄素发挥去甲基化作用和其抑制甲基转移酶表达相关。

大黄素对胰腺癌细胞5-甲基胞嘧啶表达的影响及对抑癌基因ppENK去甲基化的作用

目的 探讨大黄素对胰腺癌细胞Panc1基因组5-甲基胞嘧啶(5 mc)表达的影响及对抑癌基因ppENK启动子区CpG岛的去甲基化作用。方法 CCK8用于检测不同浓度大黄素对Panc1胰腺癌细胞生长的影响,摸索最佳用药浓度;Dot-blot法检测不同浓度大黄素作用下胰腺癌Pancl基因组5 mc和5-羟甲基胞嘧啶(5hmc)的改变;mRNA-Seq检测不同浓度大黄素对基因表达谱的影响,利用甲基特异性PCR(MSP)检测不同浓度大黄素对ppEnK基因甲基化状态的影响。结果 大黄素以浓度梯度和时间梯度依赖性抑制Panc1细胞生长,其半数抑制率(IC_(50))约40μmol/L。Dot-blot结果证实40μmol/L的大黄素可以明显抑制Pancl细胞基因组5mc的表达(P<0.05),但是对5hmc的表达无明显影响。mRNA-Seq表明不同浓度大黄素可使基因表达谱发生差异改变,MSP证实大黄素可使ppENK甲基化状态减弱,非甲基化状态增强。结论 大黄素可以降低胰腺癌细胞Panc1基因组5mc的表达,并对抑癌基因ppENK发挥一定程度的去甲基化作用,抑制胰腺癌细胞生长。