密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

[目的]试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。[方法]根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBacTMDual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。[结果]试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,重组杆状病毒转染Sf9细胞表达出大小约60 ku的RHDV2 VP60蛋白。IFA鉴定结果显示,感染重组杆状病毒的Sf9细胞产生了大量的黄绿色荧光,表明重组杆状病毒在Sf9细胞中大量表达VP60蛋白。透射电镜观察结果显示,VP60蛋白折叠成VLP,大小为40 nm左右,呈现球形结构,表面光滑。优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗对家兔具有良好的安全性和免疫原性,最小免疫剂量为0.5 mL/只,免疫持续期可达210 d以上。[结论]试验构建了含有密码子优化的双VP60基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中成功表达RHDV2 VP60蛋白,该蛋白制备的VLP疫苗对家兔具有良好的免疫原性。

CD4^(+)T细胞相关细胞因子在人兽共患寄生虫感染中的作用研究进展

CD4^(+)T细胞亚群及其分泌的细胞因子在寄生虫感染过程中发挥着极其重要的调控作用,与寄生虫感染的发生、发展、预后密切相关。已知CD4^(+)T细胞亚群包括Th1细胞、Th2细胞、Treg细胞、Th17细胞、Th9细胞以及Tfh细胞等,机体的Th1/Th2、Th17/Treg细胞处于动态平衡,但在特异性抗原刺激下,这种动态平衡会被打破。目前可用来预防或治疗寄生虫病的疫苗和药物较少,主要原因是对寄生虫病致病机制的认识有限。研究表明,寄生虫感染导致宿主炎症以及刺激宿主细胞介导的免疫反应有关。论文主要阐述与CD4^(+)T细胞亚群相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17、IL-9及IL-21在寄生虫感染中的作用,以期为探索和研究寄生虫病的发病机制及寄生虫在宿主体内的免疫逃逸机制提供参考。

猪δ冠状病毒重庆流行株的诊断与N基因序列分析

2023年重庆市某规模化养猪场猪群发生腹泻疫情,通过临床观察、RT-PCR检测、N基因克隆测序及序列分析对采集的腹泻仔猪肠道组织进行鉴定。结果显示,发病猪水样腹泻,小肠壁变薄、黏膜充血;成功检测到1株猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV),命名为CQ2023株。该毒株N基因序列全长1029 bp,与30株GenBank中登录的参考毒株N基因序列比对显示,核苷酸序列相似性为96.7%~99.4%,其中PDCoV CQ2023株与CHN-HeN06-2022株的相似性最高,为99.4%。遗传进化分析显示PDCoV CQ2023株属于国内流行株,与国内PDCoV毒株CHN-HeN06-2022等处于同一进化分支,亲缘关系最近。该次研究成功鉴定出该猪场腹泻疫情由PDCoV感染引起,并进行了N基因序列分析,为PDCoV的流行病学研究、遗传进化、预防及诊断试剂的研究提供数据支持。

发酵床养猪的优势和劣势分析

发酵床饲养模式是养猪业中的一种新型优质、安全、高效的饲养方式,不仅可减少养猪业的粪尿排放,提高猪肉品质和动物的免疫功能,同时在促进猪只生产性能,改善养殖环境等方面有重要意义。本文从发酵床的类型、优势和存在的问题等方面进行探讨,旨在指导养猪生产。

四川省部分规模养殖场猪繁殖与呼吸综合征病毒及猪圆环病毒2型感染情况调查

为了解四川省规模化养猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)2种猪免疫抑制类病原的感染情况,采用荧光定量RT-PCR/PCR方法,对898份采自四川省12个地区规模化猪场的组织、精液及血液样品进行PRRSV和PCV2检测与分析。结果显示:至少检出PRRSV和PCV2中一种病原的样品占67.82%,其中组织样品阳性率最高(32.96%),其次为血液(27.17%)、精液(7.68%)。从不同类别样品感染情况看,组织样品中PRRSV+PCV2混合感染率最高,达33.53%;精液样品中PRRSV单感染率最高,达53.00%;血液样品中PCV2单感染率最高,达45.27%。从不同感染类型情况看,PCV2单感染、PRRSV单感染、PRRSV+PCV2混合感染率依次下降,分别为33.18%、20.71%、13.92%;PRRSV单感染、PRRSV+PCV2混合感染率最高的均为组织样品,分别占10.58%、12.80%,PCV2单感染率最高的为血液样品,达22.94%。从不同地区感染情况看,12个地区中PRRSV和PCV2中至少一种病原为阳性的阳性率为52.17%~82.81%,其中绵阳市最高;PRRSV单感染率最高的为绵阳市(37.50%),PCV2单感染率最高的为内江市(44.44%),PCV2+PRRSV混合感染率最高的为乐山市(20.29%)。结果表明:四川省规模化养猪场中普遍存在PRRSV、PCV2单感染和混合感染,其中内江、绵阳、乐山等地的感染情况较为严重;组织样品总阳性率最高并以PRRSV+PCV2混合感染为主,精液和血液样品分别以PRRSV单感染、PCV2单感染为主。

Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型VP60蛋白重组腺病毒的构建及鉴定

【目的】试验旨在以复制缺陷型人5型腺病毒(Ad5)为载体,构建Kozak序列引导的表达兔出血症病毒2型(RHDV2)VP60蛋白的重组腺病毒,为RHDV2新型疫苗研究提供依据。【方法】修饰、合成带有Kozak序列的VP 60基因序列,将其与腺病毒穿梭质粒进行重组,转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建重组腺病毒穿梭质粒,并利用酶切与测序对重组腺病毒穿梭质粒进行鉴定;采用Ad Max腺病毒包装系统,基于HEK293细胞进行穿梭质粒与腺病毒骨架质粒的定点同源重组,构建重组腺病毒Ad5-RHDV2-VP60并感染HEK293细胞,通过RT-PCR、Western blotting及间接免疫荧光试验(IFA)对重组腺病毒进行表达验证;利用Reed-Muench方法测定重组腺病毒的病毒滴度。【结果】重组腺病毒穿梭质粒酶切鉴定结果可见2条大小分别为3895和1752 bp的条带,测序比对结果显示,其与GenBank中公布的相应序列相似性>99%,表明穿梭质粒构建成功。RT-PCR结果可见大小约为515 bp的特异性条带;Western blotting结果显示,大小约为60 ku的VP60蛋白特异性条带;IFA观察结果显示,感染重组腺病毒的HEK293细胞产生了绿色荧光,表明重组病毒能在HEK293细胞中表达VP60蛋白,且该蛋白具有良好的抗原性;病毒滴度测定结果显示,初代重组腺病毒的TCID_(50)为10^(5.5)/0.1 mL。【结论】本试验构建了含RHDV2 VP 60基因的重组腺病毒,并成功表达了RHDV2 VP60蛋白,为进一步研究开发RHDV2疫苗提供了病毒模型。

四川规模兔场球虫病流行病学调查

为掌握四川规模化养兔场球虫感染情况,本研究采用麦氏虫卵计数法和PCR方法对四川东、西、南、北及成都附近15个规模化养兔场共450份粪样进行了检测。结果表明,四川规模兔场兔球虫总感染率为71.11%,流行种类达9种,其中巨型艾美耳球虫、中型艾美耳球虫和黄艾美耳球虫场阳性率分别达100%、93.33%和93.33%,其次为穿孔艾美耳球虫73.33%、无残艾美耳球虫60%、斯氏艾美耳球虫46.66%、盲肠艾美耳球虫46.66%、梨形艾美耳球虫40%和小型艾美耳球虫26.67%;1~3月龄幼兔球虫感染率和感染程度明显高于4~6月龄商品兔和6月龄以上种兔,感染率达96%,平均OPG为14913。研究表明,四川规模兔场球虫感染率高,需加强对1~3月龄幼兔的球虫防控。

四川省放牧地方黑猪的寄生虫病调查与分析

为提高放养地方黑猪寄生虫病防治效果,采用猪粪便中虫卵计数和刮屑镜检方法,对四川省9个区县13个种养结合模式放牧地方黑猪场的粪便和发酵处理肥料中寄生虫虫卵或卵囊进行了检测,并对地方黑猪进行体表寄生虫检查,同时采用现场观察和问卷方式调查寄生虫病流行因素。结果表明,四川省放牧地方黑猪的寄生虫种类主要有蛔虫、毛首线虫、其他线虫、球虫和疥螨;放牧黑猪的寄生虫病感染率和感染程度与驱虫药物的使用和活动场粪污清理频率有关。

昭觉县不同地理条件下凉山半细毛羊寄生虫感染情况调查

为掌握当前昭觉县不同地理环境中凉山半细毛羊寄生虫病流行特点,本试验采集昭觉县在高山地区、平坝地区、河谷地区的凉山半细毛羊新鲜羊粪便共计69份,采用寄生虫虫卵计数方法对粪便中寄生虫种类及感染情况进行计数。结果表明昭觉县凉山半细毛羊感染的主要寄生虫为肝片吸虫、前后盘吸虫、鞭虫及其他线虫;寄生虫感染率和感染程度随不同海拔而不同,即高山地区寄生虫检出率最低,平坝地区略高,河谷地区最高。

流产奶牛胎儿肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

从流产奶牛胎儿组织中分离到1株革兰氏阴性短杆菌,采用细菌分离纯化、生化试验、16S rRNA和16S～23S rRNA测序、药敏试验和小鼠致死性试验对其进行了鉴定。结果显示,该分离菌与GenBank中肺炎克雷伯氏菌16S rRNA和16S～23S rRNA基因序列一致性分别高达99%和96%,16S～23S rRNA基因被扩增出3条不同长度条带;该菌生化特性均符合肺炎克雷伯氏菌的生化反应特性;对头孢曲松、阿米卡星、多粘菌素等敏感,对多西环素、四环素、卡拉霉素等中度敏感,对青霉素、红霉素、米诺环素等耐药;对小鼠有很强的致病性。以上结果表明,该分离细菌为肺炎克雷伯氏菌。

四川部分地区半舍饲肉羊消化道蠕虫感染调查

为掌握四川半舍饲肉羊消化道蠕虫病的感染情况,试验采用廖氏法对四川6个市州的13个半舍饲羊场共计289份新鲜羊粪,进行了寄生虫种类和感染程度鉴定,随后对19只粪检阳性羊进行蠕虫剖检和成虫内转录间隔区(ITS)基因序列扩增测序。结果表明,四川半舍饲肉羊消化道蠕虫感染阳性率为64.36%(186/289),每个养殖场至少感染2种消化道蠕虫,其中线虫感染率最高,达60.55%(175/289),其次为片形吸虫、同盘吸虫和绦虫,阳性率分别为15.22%(44/289)、14.88%(43/289)和2.08%(6/289);线虫、片形吸虫和同盘吸虫的平均每克粪便虫卵数(EPG)分别为1197(56~28187)、527(51~1407)和413(63~1291);四川半舍饲肉羊流行12种消化道蠕虫,即肝片形吸虫、大片形吸虫、鹿同盘吸虫、鹿列叶吸虫、捻转血矛线虫、羊夏伯特线虫、粗纹食道口线虫、羊毛首线虫、达氏背板线虫、普通奥斯特线虫、贝氏莫尼茨绦虫和扩展莫尼茨绦虫。生产上需加大对此类寄生虫病尤其线虫病的防控。

奶牛蹄病综合防控措施效果观察

蹄病是奶牛的主要疾病之一,能够引起奶牛泌乳量减少、繁殖力降低以及淘汰率升高,给奶牛业造成了巨大的经济损失。本研究以洪雅县某奶牛场为调查对象,于2010年全场牛群修蹄时进行了蹄病调查。通过对病因的分析并针对牛场实际情况,2011年对综合防治措施进行了调整,实施新措施一年后,再次对奶牛蹄病进行检测,评价了调整后的措施对蹄病防治的效果。

若尔盖县牦牛及藏系绵羊寄生虫病调查

本文通过剖检20头牦牛和镜检30份新鲜藏系绵羊粪便,对若尔盖县牛羊进行了寄生虫病调查。结果表明:感染牛羊的寄生虫主要为前后盘吸虫、鞭虫、仰口线虫、绦虫和牛蝇蛆,其中前后盘吸虫的危害最大。

四川部分地区肉鸡球虫病调查与药物治疗试验

为调查四川地区肉鸡球虫病流行现状,并筛选抗肉鸡球虫的有效药物,我们开展了本试验。结果表明,四川地区肉鸡球虫病感染场阳性率达95.24%,流行的球虫种类为柔嫩艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫和巨型艾美耳球虫;妥曲珠利和磺胺氯吡嗪钠可溶性粉比复方磺胺氯吡嗪钠预混剂的短期驱虫效果更好,但复方磺胺氯吡嗪钠预混剂的药效维持时间比前两种药物更长。

捻转血矛线虫虫卵体外培养观察

为了解捻转血矛线虫虫卵在体外发育过程中的形态变化,对分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫成虫进行了短暂体外培养并获得纯种成熟虫卵,同时在室温16℃~29℃条件下的生理盐水中培养虫卵,并进行形态测量和胚胎发育观察。结果表明:捻转血矛线虫虫卵呈短椭圆形,浅灰或黄褐色,多数对称,少数不对称;虫卵长81.27 μm±5.59 μm,宽54.34 μm±6.63 μm,长宽比1.51±0.14。虫卵在体外发育依次经历桑葚期、蝌蚪期和幼虫期;培养至第6 d虫卵中幼虫开始逸出,9 d后幼虫全部逸出。分离自绵羊和山羊的捻转血矛线虫虫卵在体外发育至各阶段所需时间差异不大,但在长、宽和长宽比上差异显著,具有统计学意义。

斯氏艾美耳球虫的分离、孵化与保存

斯氏艾美耳球虫的分离与孵化是进一步研究其生物特性、免疫原性的前提。本文就病料的处理、分离方法、孵化试剂选择及孵化过程中的注意事项与保存方法等进行阐述,以期为相关研究提供参考。

四川奶牛腐蹄病主要病原菌调查

奶牛腐蹄病是奶牛场最常见的疫病之一，在我国各地都表现出较高的发病率，尤其是在我国南方，其高温、高湿、集约化饲养等自然条件，奶牛场的腐蹄病更为严重。腐蹄病的发生引起奶牛产奶量下降，繁殖率，饲料报酬降低，治疗成本增加，严重者常常导致奶牛过早淘汰，从而造成巨大的经济损失。

鸡传染性喉气管炎病毒可视化LAMP快速诊断方法的建立和应用

试验旨在建立简易、快速、高效的鸡传染性喉气管炎病毒(infectious laryngotracheitis virus,ILTV)检测和诊断方法。根据GenBank上公布的ILTV TK基因序列,设计检测ILTV的特异性环介导的等温扩增(loop media-ted isothermal amplification,LAMP)技术反应引物,通过对LAMP反应体系和反应条件的优化,以及特异性、敏感性和临床样品的检测,建立了ILTV LAMP检测方法。结果显示,以内引物ILT9-FIP和ILT9-BIP、外引物ILT9-F3和ILT9-B3、环引物ILT9-LB和ILT9-LF为LAMP反应引物,反应温度为66℃时,所建立的LAMP检测方法反应效率最高;所建立的LAMP检测方法能够特异性地检测ILTV(匈牙利株和王岗株),不与新城疫病毒(NDV,B株)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV,H52株和H120株)、大肠杆菌、鸡副嗜血杆菌、巴氏杆菌等发生交叉反应,且能够检测到的病毒最低浓度达到0.06pg/μL,其灵敏度是普通PCR方法的100倍;采用建立LAMP方法对50个临床样本进行检测,阳性率为14%,且与PCR检测结果的符合率达96%。本研究建立了特异性强、灵敏度高、操作简单的LAMP检测方法,适用于临床上ILTV的快速检测和诊断。

养猪发酵床垫料中致病菌和寄生虫调查研究

为了解发酵床养猪的疫病风险,采用细菌常规分离鉴定、小白鼠攻毒、寄生虫虫卵检测方法,分别对5个养猪发酵床垫料和养猪场常规圈舍粪污内的致病菌和寄生虫虫卵进行了检测。结果显示：在发酵床垫料内分离到25种（亚种、类）致病菌,而常规饲养圈舍粪污内分离到8种（亚种、类）致病菌;发酵床垫料和常规饲养圈舍粪污内的同种致病菌的致病比较,发酵床内致病菌的致病性高于常规饲养圈舍粪污内致病菌的致病性。3个发酵床养猪时间延长1年后,发酵床垫料中的致病菌增加了4~9种（亚种、类）,其中1个发酵床的病原菌种类是1年前的3.25倍;5个养猪场的8个发酵床垫料中,有5个发酵床垫料内寄生虫虫卵呈阳性,即阳性率为62.5%,寄生虫种类为蛔虫和毛首线虫,其中,蛔虫虫卵有4个发酵床垫料呈阳性（阳性率50.0%）,毛首线虫虫卵有4个发酵床垫料呈阳性（阳性率50.0%）,对患寄生虫病最严重的1头猪进行解剖,其大肠黏膜上布满了毛首线虫。结果表明,发酵床养猪疫病风险高,不符合健康养殖范畴。

EMA-PCR检测金黄色葡萄球菌活菌的方法

根据金黄色葡萄球菌(SA)耐热核酸酶编码基因(nuc基因)设计特异性引物,对试验菌株进行PCR检测,结果显示,金黄色葡萄球菌扩增出大小为480bp的特异性条带,而其他对照菌株未扩增出条带。由于传统PCR技术无法区分样品中的死细菌与活细菌,从而使检测结果往往出现很高的假阳性。本试验利用EMA能穿过死细菌的细胞膜并在光激活的作用下能与基因组DNA共价结合,从而能抑制死菌DNA进行PCR扩增的特性,建立了一种快速、有效的检测金黄色葡萄球菌活菌的EMA-PCR方法,较传统PCR大大提高了检测的准确性和可靠性,该方法检测灵敏度可达15CFU/mL。