sFRP5抑制Wnt3a对黑素细胞黑素形成作用的初步研究

目的研究sFRP5抑制Wnt3a对黑素细胞黑素形成的作用。方法以永生化的黑素细胞为模型,利用腺病毒表达载体,设置Control组、Wnt3a处理组、Wnt3a+sFRP5处理组进行以下实验:L-DOPA测定酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)活性;Masson-Fontanas银染色法观察黑素形成情况;RT-PCR检测酪氨酸酶相关蛋白1(tyrosinase-related protein 1,TRP-1)、TYR基因的表达;Western blot检测TRP-1、TYR蛋白的表达水平。结果 L-DOPA测定酪氨酸酶活性结果显示Wnt3a+sFRP5处理组TYR活性低于Wnt3a处理组,差异有统计学意义(P<0.05);Masson-Fontanas银染色法显示Wnt3a+sFRP5处理组形成的黑素明显低于Wnt3a处理组;RT-PCR检测结果显示Wnt3a+sFRP5处理组能下调TRP-1、TYR基因的表达(P<0.05);Western blot检测结果显示Wnt3a+sFRP5处理组能下调TRP-1、TYR蛋白的表达水平(P<0.05)。结论 sFRP5能抑制Wnt3a对黑素细胞黑素生成的作用。

水通道蛋白3在高渗环境诱导髓核细胞凋亡中的作用

目的研究水通道蛋白3(aquaporin-3,AQP-3)在高渗透压诱导的大鼠髓核细胞(rat nucleus pulposus)凋亡中的作用。方法体外培养的大鼠髓核细胞,按330、550 mOsm/kg的渗透压分组,CCK-8检测髓核细胞增殖,流式细胞分析细胞凋亡率,Western blot和定量PCR检测凋亡相关分子Bcl-2、Bax和caspase3表达情况;使用免疫细胞化学、Western blot和定量PCR检测AQP-3的表达。利用过表达慢病毒提高AQP-3的表达,进一步观察AQP-3对高渗环境诱导凋亡的影响。结果相比于330 mOsm/kg渗透压,550 mOsm/kg高渗环境中髓核细胞培养12、24、48、72 h细胞增殖显著降低,髓核细胞凋亡率显著增加(P<0.05),蛋白和mRNA表达结果显示Bcl-2表达明显降低(P<0.05),Bax和cleaved caspase 3/caspase 3表达明显增加(P<0.05)。相比于高渗环境中的空白对照髓核细胞,AQP-3过表达髓核细胞的凋亡率显著降低(P<0.05),蛋白和mRNA表达结果显示Bcl-2表达明显增加(P<0.05),Bax和cleaved caspase 3/caspase 3表达明显降低(P<0.05)。结论高渗透压显著促进髓核细胞的凋亡并降低AQP-3的表达;过表达AQP-3可缓解高渗透压环境下髓核细胞凋亡。

碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白在Origami2体系中的可溶表达及二者促成骨的协同效应

目的建立优化高效的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP-2)蛋白重组方法,阐明二者在促成骨中的协同效应。方法优化bFGF和BMP-2成熟肽的基因序列密码子,获得适用于大肠杆菌Origami2体系表达的bFGF及BMP-2成熟肽cDNA片段;利用PCR法将bFGF成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pColdⅡ中,构建重组原核表达质粒pColdⅡ-bFGF;利用PCR法将BMP-2成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-BMP-2,转入大肠杆菌Origami2中表达纯化;运用双酶切、质粒测序及Western blot技术证明Origami2表达体系的构建效果;进行细胞增殖实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)染色观察和体内成骨效率检测等,探索bFGF、BMP-2在促成骨中的协同效应。结果双酶切和质粒测序鉴定证明成功构建重组大肠杆菌pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,Western blot检测发现蛋白正确表达。经过Ni-NTA亲和层析纯化后bFGF及BMP-2纯度高达90%。通过对二者比例的优化筛选,发现40 ng/mL bFGF+40 ng/mL rh BMP-2时,大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖效率、ALP活性及体内成骨效率最高,是二者促成骨的最优效组合。结论成功构建高效表达的pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,实现了bFGF及BMP-2的高效表达。bFGF和BMP-2的优化联合应用具有促成骨协同效应。

复合骨再生支架的构建及其促大鼠肌袋成骨活性的价值

目的构建丝素蛋白(SF)、细菌纤维素(BCNR)、羟基磷灰石(HAp)复合骨再生支架并评价其促成骨活性的价值。方法将HAp颗粒、BCNR和骨形态发生蛋白2(BMP2)依次加入SF水溶液中,搅拌均匀后倒入不同大小的模具,-25℃下处理24 h,冷冻成型,通过冻干机将复合支架冻干。将SF与BCNR不同质量比的复合支架设置为A组(2∶1)、B组(4∶1)、C组(6∶1),将未加入BMP2的无活性复合支架设置为D组。扫描电镜检测支架的表面形貌和孔隙结构;压汞仪检测支架的孔隙率;万能材料试验机压缩支架,获得应力⁃应变曲线,分析支架的压缩强度和杨氏模量。将永生化小鼠胚胎成纤维细胞(iMEF)接种到A组、B组、C组及D组复合支架上。细胞接种4、8 d后,细胞活/死染色检测各组活细胞和死细胞比例;细胞计数试剂盒8(CCK⁃8)实验检测各组细胞的增殖活性;碱性磷酸酶(ALP)染色检测各组染色阳性细胞;ALP活性检测观察各组细胞的ALP活性。选取15只雌性SD大鼠,构建大鼠肌袋异位成骨模型,植入不同SF与BCNR质量比的复合支架及未加入BMP2的无活性复合支架,分别为A′组(2∶1)、B′组(4∶1)、C′组(6∶1)和D′组,另设假手术组,每组3只。假手术组在切开皮肤、钝性分离股四头肌肌肉,于肌肉中形成肌袋后,仅缝合肌袋及皮肤,不植入支架,其他四组在肌袋内植入对应的支架,并缝合肌袋及皮肤。术后2、4周行X线片检查,观察各组骨形成情况。术后4周,收集植入的支架与组织复合物,进行病理组织切片、HE染色和Masson染色,观察各组成骨情况。另对组织切片进行免疫组化染色,观察各组成骨标志物Ⅰ型胶原蛋白(COL1)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况。结果扫描电镜显示,相较于A组和C组,B组片层结构和微孔结构更加规则、均匀;孔隙率分析结果表明,B组和C组孔隙率分别为(89.752±1.866)%和(84.257±1.013)%,均高于A组的(81.171±1.268)%(P<0.05或0.01),而C组孔隙率低于B组(P<0.01)。力学性能检测结果显示,B组和C组压缩强度分别为(0.373±0.009)MPa和(0.403±0.017)MPa,均高于A组的(0.044±0.003)MPa(P<0.01),B组和C组杨氏模量分别为(7.413±0.094)MPa和(9.515±0.615)MPa,均高于A组的(1.881±0.036)MPa(P<0.01),而C组压缩强度和杨氏模量均高于B组(P<0.05或0.01)。细胞活/死染色结果显示,细胞接种4 d后,B组死细胞明显少于A组、C组和D组;细胞接种8 d后,B组活细胞最多,死细胞最少。CCK⁃8实验结果显示,细胞接种4 d后,A组和B组细胞增殖活性分别为0.474±0.009和0.545±0.018,均高于D组的0.394±0.016(P<0.01),C组细胞增殖活性为0.419±0.005,与D组差异无统计学意义(P>0.05),而A组和C组细胞增殖活性均低于B组(P<0.01);细胞接种8 d后,B组细胞增殖活性为1.290±0.021,高于D组的1.047±0.011(P<0.01),C组细胞增殖活性为0.794±0.032,低于D组(P<0.01),A组细胞增殖活性为1.086±0.020,与D组差异无统计学意义(P>0.05),而A组和C组细胞增殖活性均低于B组(P<0.01)。ALP染色结果显示,细胞接种4、8 d后,相较于D组,A组、B组和C组有更多的阳性细胞,B组阳性细胞多于A组和C组。ALP活性检测结果显示,细胞接种4 d后,A组、B组和C组细胞ALP活性分别为1.399±0.071、1.934±0.011、1.565±0.034,均高于D组的0.082±0.003(P<0.01),而A组和C组细胞ALP活性均低于B组(P<0.01);细胞接种8 d后,A组、B组和C组细胞ALP活性分别为2.602±0.055、3.216±0.092、2.145±0.170,均高于D组的0.101±0.001(P<0.01),而A组和C组细胞ALP活性均低于B组(P<0.01)。X线片检查结果显示,术后2周,假手术组、D′组、A′组和C′组均无明显骨形成,而B′组有明显骨形成;术后4周,A′组、B′组和C′组均有明显骨形成,B′组骨形成明显多于其他两组,而假手术组和D′组均无明显骨形成。HE染色和Masson染色结果显示,术后4周,B′组形成大量均匀分布的新生骨组织,而A′组和C′组只在局部有少量新生骨组织,D′组仅有部分组织长入,且无明显新生骨组织,B′组形成的新生骨组织的成熟度比A′组和C′组更高。免疫组化染色结果显示,B′组COL1和OPN阳性染色均较A′组和C′组更多。COL1和OPN表达强度分析结果显示,A′组、B′组和C′组COL1表达强度分别为2.822±0.384、22.810±2.435、12.480±0.912,OPN表达强度分别为1.545±0.081、5.374±0.121、2.246±0.116,B′组和C′组COL1、OPN表达强度均高于A′组(P<0.01),而C′组COL1和OPN表达强度均低于B′组(P<0.01)。结论基于SF、BCNR和HAp成功构建复合骨再生支架,其中SF和BCNR质量比为4∶1的复合支架具有均匀孔隙结构、高孔隙率、良好的力学性能和生物相容性、优异的体外促成骨性能,还具有优异的骨诱导性和骨传导性。