10株蜃楼弗朗西斯菌的鉴定与特征分析

目的对10株蜃楼弗朗西斯菌样细菌进行菌种鉴定和特征分析。方法对环境水源及临床患者样本中分离的10株实验菌株,进行菌体形态和生长特征观察、生化表型鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定和16S rRNA测序分析。E-test方法检测菌株对各种药物的最低抑菌浓度(MIC)。结果该10株菌均为着色较淡的革兰阴性小球杆菌;尿素酶阴性、硝酸盐还原试验阴性、V因子和X因子需求试验阴性,氧化酶和触酶试验阳性;在M-H平板和麦康凯平板上不生长,血平板、巧克力平板和BCYE平板上生长迅速,可形成白色不透明型、无色透明型和灰色光滑型,直径约2 mm大小的菌落。16S rRNA基因测序显示,该10株菌与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015同源性在99.6%以上,系统发育分析亦位于同一个分枝上。MALDI-TOF MS分析显示,该10株均含有6 153 m/z、5 180 m/z、7 757 m/z和9 392 m/z等特征峰,与蜃楼弗朗西斯菌ATCC 25015类似。采用Vitek 2 GN卡及NH卡、API 20NE及NH试条则可能错误鉴定为少动鞘氨醇单胞菌、灰色奈瑟菌、气味黄杆菌和嗜血杆菌等。药敏试验显示,对氯霉素、多西环素、庆大霉素、四环素、氧氟沙星和环丙沙星等均敏感。结论该10株菌可鉴定为蜃楼弗朗西斯菌,其生化反应不活泼,常规方法鉴定会发生错误,应予以重视。

ITS基因测序分析对89株病原真菌鉴定的应用评价

目的探讨内转录间隔区(ITS)基因扩增测序技术在病原真菌鉴定中应用价值。方法应用通用引物ITS1和ITS4对收集的89株真菌(包括酵母菌标准菌株6株,室间质评菌7株,临床分离的酵母样真菌42株和丝状真菌34株)进行PCR扩增和基因测序。测序成功的ITS序列在CBS数据库(http://www.cbs.knaw.nl/Collections)进行序列比对,结合Mycobank(http://cn.mycobank.org/)分类信息以获得其菌种鉴定信息。结果 89株不同种类的真菌均成功扩增到ITS靶基因,经测序,89株真菌均获得扩增的全序列。序列比对结果显示,6株酵母菌标准株中,5株鉴定到种,1株鉴定到属;7株室间质评株中,1株酵母菌鉴定到种,6株丝状真菌中2株鉴定到种,1株鉴定到属,3株鉴定到复合群;42株临床分离的酵母样真菌中,39株鉴定到种,3株鉴定到属;34株临床分离的丝状真菌中,10株鉴定到种,18株鉴定到属,6株鉴定为复合群。结论通用引物ITS1和ITS4广谱性强。ITS基因序列扩增和测序分析可快速、有效鉴定临床疑难真菌,但仍存在数据分析过程烦琐和结果解释困难的问题。

5株玫瑰单胞菌的临床分离、鉴定和特征分析

目的:对2011-2013年我院收集的5株来源临床的玫瑰单胞菌进行分析,探讨玫瑰单胞菌的病原学特点。方法:采用生化鉴定、API 20NE、Vitek系统GN卡、Rap ID NF和16S rRNA基因测序对该5株菌进行鉴定,Kirby-Bauer法进行药敏试验。结果:玫瑰单胞菌不在API 20NE和Vitek鉴定的数据库范围内;Rap ID NF数据库涵盖了玫瑰单胞菌,但仅2株正确鉴定为玫瑰单胞菌属。采用16S rRNA基因测序分析,5株菌分别鉴定为黏液玫瑰单胞菌(3株)、吉氏玫瑰单胞菌(1株)和河口玫瑰单胞菌(1株)。药敏结果显示,5株菌对碳青酶烯类、氨基糖苷类和喹诺酮类药物均敏感,对单环内酰胺类、青霉素类和头孢类等抗菌药物呈现广泛耐药。结论:16S rRNA基因测序是玫瑰单胞菌最佳的临床鉴定方法,玫瑰单胞菌对抗菌药物呈现耐药应引起临床重视。

耐亚胺培南鲍曼不动杆菌的耐药机制研究和同源性分析

目的研究鲍曼不动杆菌耐药性的变迁及耐亚胺培南鲍曼不动杆菌(IRAB)的耐药机制及同源性,为临床抗感染治疗及医院感染控制提供依据。方法采用Vitek 2 Compact全自动微生物鉴定仪进行菌株鉴定和药敏实验。收集2011至2014年间1 761株鲍曼不动杆菌,其中IRAB 1360株。随机选取对亚胺培南耐药和敏感的鲍曼不动杆菌,分为耐药组(66株)及对照(敏感)组(14株),用PCR方法进行A^D类β-内酰胺酶、外膜孔通道蛋白和主动外排泵基因检测,采用脉冲场凝胶电泳对菌株进行分子分型,用BioNumeric软件进行聚类分析。结果1761株鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药率逐年下降,由84.0%降至71.8%。同时,鲍曼不动杆菌对多种抗生素的耐药率也逐年下降。耐药组耐药基因TEM、AMPC、OXA-51的阳性率分别为95.45%、98.48%、96.97%,对照组分别为35.71%、64.29%、71.43%,耐药组均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。OXA23、OXA58仅在耐药组中检出,阳性率分别为95.45%和1.52%。其余耐药基因在2组中均未检出。80株鲍曼不动杆菌分为A^W共23个型别,耐药组主要为P1型(16株),R1型(4株)和R2(12株)型,对照组分布分散,其中R4型同时存在于耐药组和对照组。2012年2次暴发流行,分别为P1型(9月-11月)(MICU、SICU),R2型(9月-11月)(MICU);2013年2次暴发流行,分别为P1型(4月-6月)(MICU、SICU、神经科),R1型(2013年12月-2014年2月)(MICU、神经科);2014年一次暴发流行,流行菌株为R2型(2月-4月)(MICU、SICU、神经科)。结论耐亚胺培南鲍曼不动杆菌对多种抗生素的耐药率较高。鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的主要机制为携带OXA23基因,产生D类β-内酰胺酶水解亚胺培南。MICU、SICU和神经科是暴发流行监控的重点科室。

大肠埃希菌sdiA基因缺失株的建立

目的为研究HSL信号分子对大肠埃希氏菌的影响而建立大肠埃希菌sdiA基因缺失株。方法通过Red重组系统敲除大肠杆菌BW25113和SM10λpir的sdiA基因,PCR测序鉴定;不同时间点检测A600值,绘制细菌生长曲线;荧光定量PCR检测csgD、csgB基因水平。结果 PCR测序结果经DNAman软件比对分析,与预想结果一致;与野生株相比,sdiA基因突变对细菌生长曲线无明显影响。结论成功建立BW25113、SM10λpir的sdiA基因缺失株,为后续研究铜绿假单胞菌信号分子HSL对大肠埃希菌的影响奠定了基础。

集中空调系统中弗朗西斯菌的分离与鉴定

目的 对集中空调系统中的弗朗西斯菌进行分离鉴定. 方法 收集2008—2014年广州市集中空调系统的324份冷却水和36份冷凝水水样,经负压膜过滤集菌、酸处理后接种军团菌选择性甘氨酸-万古霉素-多黏霉素B-放线菌酮（ BCYEα-GVPC）培养基进行细菌分离培养,通过培养特征、生化反应特性等表型分析及弗朗西斯菌属特异性引物PCR鉴定、16S rRNA 基因序列分析、基因组DNA-DNA杂交等方法进行菌种鉴定. 结果 从14份集中空调冷却水中分离到15株菌,经表型分析和弗朗西斯菌属特异性引物PCR扩增确定为弗朗西斯菌,水样的阳性率分别为：冷却水4.3%,冷凝水0%. 15个分离菌株的16S rRNA 基因序列分析及系统发育分析显示,其可分为4个分支,包括为广州弗朗西斯菌9株,蜃楼弗朗西斯菌1株,另2个分支的5株菌与广州弗朗西斯菌亲缘关系最接近,但基因组DNA-DNA杂交证明与广州弗朗西斯菌同源性〈70%,初步确定为弗朗西斯菌属内的候选新种. 结论 广州市集中空调系统水样弗朗西斯菌阳性率低,且未发现强致病性的土拉热弗朗西斯菌.