质体基因工程中选择标记基因研究进展

与细胞核基因工程相比,质体基因工程能更安全、精确和高效地对外源基因进行表达,作为下一代转基因技术已广泛用于基础研究和生物技术应用领域。与细胞核基因工程一样,质体基因工程中也需要合适的选择标记基因用于转化子的筛选和同质化,但基于质体基因组的多拷贝性和母系遗传特点,转化子的同质化需要一个长期的筛选过程,这就决定了质体基因工程中选择标记基因的选择标准将不同于细胞核基因工程中广泛使用的现行标准。目前,质体基因工程的遗传转化操作中使用较多的是抗生素选择标记基因,出于安全性考虑,需要找到可替换、安全的选择标记基因或有效的标记基因删除方法。本文在对质体基因工程研究的相关文献分析基础之上,对主要使用的选择标记基因及其删除体系进行了综述,并对比了其优缺点,同时探讨了质体基因工程中所使用的报告基因,以期为现有选择标记基因及其删除体系的改进和开发提供一定参考,进一步推动质体基因工程,尤其是单子叶植物质体基因工程的发展。

紫龙角愈伤组织诱导与植株再生的研究

以紫龙角的不同器官为试材,研究不同植物生长调节剂浓度及组合、培养基、光照、外植体等因素对其愈伤组织诱导和植株再生的影响。结果表明:愈伤组织诱导的最佳外植体是不带腋芽茎块,在麦基1号+CH+6-BA 1.0～1.8mg/L+2,4-D 0.5～2.0mg/L的培养基上,暗培养6d时诱导率高达90%以上;质地紧密,有一定疏松度,是建立细胞无性系的优良材料。带腋芽茎块是直接诱导丛生芽的理想外植体,H+TDZ 4mg/L+NAA 0.4mg/L培养基适合丛生芽生长、增殖诱导率达到91%。复壮增殖不定芽的培养基为改良的H+TDZ 4mg/L+NAA 0.4mg/L;1/2MS+NAA 2.5mg/L是最佳生根培养基,每个不定芽平均有效根数最高为6.17个。

印度梨形孢增强棉苗对渍水胁迫的抗性

用柯字棉Cocer312进行盆栽试验,研究印度梨形孢(Pirformaspore indica P.)对苗期渍水胁迫下棉花生长的影响,设置不渍水+不加菌、不渍水+苗龄15 d加菌、不渍水+苗龄45 d加菌、渍水+不加菌、渍水+苗龄15 d加菌及渍水+苗龄45 d加菌6种处理,分别在渍水胁迫前、胁迫解除时和胁迫解除10 d后取功能叶片测定相关指标。渍水胁迫对棉苗产生巨大危害,加入的印度梨形孢能定殖在棉花(Gossypium spp)根部,促进棉花的生长发育,并在一定程度上提高棉花对渍水逆境的抗性。而且在渍水逆境来临之前,该菌有效定殖更有利于诱导棉花的抗渍性。

内生真菌印度梨形孢对水稻苗期耐盐性的影响

【目的】研究印度梨形孢(Piriformospora indica)对盐(NaCl)胁迫后水稻幼苗生长发育的影响,明确印度梨形孢提高水稻幼苗耐盐性的机理。【方法】采用不同浓度(0、50、100、150和200 mmol/L)的盐(NaCl)溶液处理水稻幼苗,72 h后加入5×10~5个/mL的印度梨形孢孢子悬浮液10 mL侵染水稻根部(接种处理),以未侵染为对照(不接种,CK);20 d后测定水稻幼苗叶片的丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性等生理指标,并利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测耐盐相关基因的表达情况。【结果】盐胁迫处理后,与CK相比,接种处理水稻幼苗的MDA含量降低,叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量及抗氧化酶活性升高。其中,盐胁迫浓度为150和200 mmol/L时,CK的MDA含量是接种处理的1.5和2.8倍;盐胁迫浓度为150 mmol/L时,接种处理的Pro含量是CK的2.1倍;盐胁迫浓度为200 mmol/L时,接种处理的可溶性糖含量是CK的1.8倍;差异均达显著水平(P<0.05,下同)。qPCR检测结果表明,经盐胁迫后接种处理水稻幼苗叶片中耐盐相关基因SNAC1、OsNAC6、OsBZIP23和OsDREB2A的表达量均高于CK,各基因表达量均在100 mmol/L处理下达最大值,其中SNAC1和OsNAC6基因表达量分别是CK的1.5和1.1倍,差异达显著水平。【结论】接种印度梨形孢可降低盐胁迫后水稻幼苗叶片的MDA含量,提高抗氧化酶活性及Pro、叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量,同时促使水稻叶片中耐盐胁迫相关基因的表达量上调,从而增强水稻幼苗对盐胁迫的耐受性。印度梨形孢作为生物菌肥在农业生产中有潜在的利用价值。

印度梨形孢最适培养基的筛选及其对水稻的促生作用研究

【目的】内生真菌印度梨形孢Piriformospora indica(Pi)可定殖在多种植物根系中,促进植物生长发育,增强植物抗逆性。【方法】将印度梨形孢接种至8种供试培养基中,测定其在8种培养基中的生长速率,并将印度梨形孢与水稻幼苗共培养,分析印度梨形孢对水稻幼苗株高、叶长、根长、根数、鲜重和叶绿素含量等生物学性状的影响。【结果】8种供试培养基中,V8培养基是最适合印度梨形孢生长的培养基,且加入一定量蔗糖能进一步促进印度梨形孢的生长;研究还发现,接种了印度梨形孢的水稻株高、叶长、根长、根数、叶绿素含量和地上地下部鲜质量都显著高于对照;与对照相比,接种印度梨形孢20 d后的水稻,其株高增高了32.36%,叶绿素含量提高了15.88%。【结论】印度梨形孢是通过增加光合作用和增强根系生理机能,从而促进水稻的生长发育。

印度梨形孢(Piriformospora indica)的生物学特性及对植物生长的互作效应研究进展

印度梨形孢(Piriformospora indica)发现于印度北部沙漠地区植物根系,具有多种多样的生物学功能,可以促进植物生长,提高植物对生物逆境与非生物逆境的忍耐性。简要综述了印度梨形孢在定殖过程、生物学功能和菌肥制作应用方面的研究进展。

植物耐盐性:演化和盐基因组学

由于社会的发展需要使用盐地产出植物,因此植物耐盐性的研究变得日益重要。植物在长期演化中主要形成嗜盐植物和非嗜盐植物两类,在细胞乃至群体处理盐的机制方面发生了广泛和深度的遗传变异。鉴于发掘植物耐盐、使植物耐盐和改变植物盐环境的各领域都取得了重大进展,结合植物的演化扩展对植物耐盐的认识,从细胞机制、个体机制扩展到群体机制乃至多基因组参与的生态互作,进行以盐基因组学为视角的研究就显得非常重要。本文根据该领域的新近进展,对植物耐盐性进行演化和组学视角的回顾和分析,以期对今后的植物耐盐研究提供参考。

文心兰类原球茎形态建成及电子传递蛋白和凯氏带蛋白基因的极性表达模式分析

以文心兰‘柠檬绿’(Oncidium hybridum‘Honey Angel’)为材料进行类原球茎发育过程的形态和结构观察,对其离体形态建成进行分析,并对类原球茎(protocorm-like body,PLB)分化过程中的顶部和基部组织以及组培苗的根、茎、叶中的凯氏带蛋白基因CASP和电子传递蛋白基因Fd(ferredoxin)、FNR(ferredoxin-NADP+oxidoreductase)的表达模式进行分析。结果显示:类原球茎在分化过程中逐步建立了两极性。随着类原球茎的发育,自顶端向基部形成维管形成层,继而形成维管束;之后有叶原基产生并形成单子叶式茎尖结构和出现类原球茎胚轴的伸长,无胚根形成。类原球茎形成幼苗后植株基部有侧根的产生。实时荧光定量PCR结果表明:在根中高表达和在茎中高表达的CASP、FNR和Fd基因在类原球茎不同发育阶段和组织中存在极性的差异表达,参与了无胚根体细胞胚胎的生长发育过程。综上所述,文心兰体细胞胚在发育过程中从弱分化器官向茎叶器官转变,形成兰花特有的非同步体细胞胚胎发育现象——类原球茎。

MAD2在文心兰‘柠檬绿’和拟南芥中的差异分析

[目的]探究MAD2基因在文心兰‘柠檬绿’和拟南芥不同育性的株系中表达量的差异。[方法]通过对模式植物拟南芥的AtMAD2基因突变体的表型、结荚情况和花粉粒活力分析,结合已有研究结果综合分析拟南芥和文心兰中MAD2的表达差异。[结果]mad2突变体的抽梗时间早于野生型约4天。果荚长度单果荚种子数量都显著低于野生型植株,其中mad2突变体的果荚长度约为0.79 cm,单荚种子数约为7粒,野生型分别为1.07 cm、19粒。野生型拟南芥的花粉活力染色率为94%,mad2突变体的花粉活力染色率仅为69%,且拟南芥mad2突变体花粉粒部分发育异常。[结论]MAD2确实是影响花粉发育的关键基因之一,但在文心兰中育性与表达量同低,而在拟南芥中表达量增加会导致育性降低。

文心兰不育花粉粒形态观察及相关基因克隆与表达分析

该研究以文心兰品种‘柠檬绿’(雄性不育)和‘巧克力’(可育)为试验材料,对花粉团和花粉粒的形态进行观察,并在转录组数据分析的基础上,利用RT-PCR技术从‘柠檬绿’中克隆了1个MYB转录因子基因(OnMYB106),用qRT-PCR技术分析该基因的相对表达量,以初步鉴定‘柠檬绿’花粉败育特征,揭示花粉败育与OnMYB106基因的调控关系。结果显示:(1)‘柠檬绿’花粉团药室明显变扁,外壁凹陷、皱缩。(2)‘柠檬绿’花粉细胞内含物缺失,细胞质空泡化严重,花粉粒形态异常,花粉壁发育不连续,有许多孔洞(并非萌发孔)。(3)成功克隆获得‘柠檬绿’MYB106的基因序列,命名为OnMYB106,其开放阅读框为819bp,编码272个氨基酸;其基因组序列与cDNA比对显示,OnMYB106基因含有3个外显子和2个内含子。(4)生物信息学分析表明,OnMYB106属于SANT超家族,具有2个连续的MYB DNA-binding结构域,是一个典型的R2R3-MYB转录因子;进化树分析表明,OnMYB106与高粱、水稻和二穗短柄草的MYB106蛋白序列的一致性最高,进化距离最近。(5)qRT-PCR分析显示,OnMYB106在‘柠檬绿’花粉团中下调表达;该基因在‘柠檬绿’不同组织器官中均有表达,但在花中表达量最高,假鳞茎中表达量最低;在不同花期中,花苞期表达量最高,盛开期只有微量表达。研究认为,‘柠檬绿’花粉壁发育异常可能导致其花粉败育;OnMYB106基因可能在‘柠檬绿’花器官的生长发育中起重要的调控作用,并且该基因可能属于花粉发育"早期"表达基因,主要影响‘柠檬绿’花粉壁的的形成。

野生干巴菌(Thelephora ganbajun M. Zang)在中国的新分布

报道福建北部山区三明地区及台湾中部南投山区所采集的真菌标本,经过形态特征、显微构造及ITS序列分析与鉴定,确认为干巴菌(Thelephora ganbajun M. Zang)。结合文献分析,认为干巴菌的生长分布范围在21°N-27°N之区域。此发现提供了干巴菌在中国新的分布地区,丰富了中国干巴菌的分布资料。

ABA和NO在印度梨形孢提高玉米苗期抗旱性的作用

为明确脱落酸(ABA)和一氧化氮(NO)在印度梨形孢调控玉米耐旱性中的作用,本研究采用15%的聚乙二醇(PEG)对接种及未接种印度梨形孢的玉米幼苗进行模拟干旱胁迫,比较分析两者在受干旱胁迫后ABA含量、NO含量以及NO处理后程序性细胞死亡(PCD)相关基因表达水平的差异。分析表明:接种印度梨形孢能明显缓解PEG模拟干旱胁迫对玉米生长的抑制作用。在干旱条件下,印度梨形孢接种处理的玉米叶片中的ABA含量高于未接种处理玉米叶片。接种印度梨形孢能显著诱导玉米叶片中ABA合成关键基因ZEP的表达,与叶片中ABA含量的积累情况类似。在干旱胁迫条件下,接种印度梨形孢的玉米叶片中NO含量高于未接种处理的玉米叶片。在NO供体硝普钠(SNP)处理5 d后,ZEP基因的表达量在根和叶片中显著增加。在SNP处理3 d和5 d后,玉米叶片中抗病相关基因Rp1-D21上调表达,而在根中Rp1-D21基因的表达被抑制。接种印度梨形孢能诱导Rp1-D21基因在玉米根和叶中的表达。Bax-I基因在接种印度梨形孢的玉米叶片和根系中相较于未接种的植株更早且更剧烈地被诱导表达。研究表明,印度梨形孢通过调节ABA、NO以及程序性细胞死亡相关基因的表达来提高玉米的抗旱能力。

文心兰‘南茜’谷氧还蛋白基因克隆定位及表达

为研究文心兰谷氧还蛋白超家族基因ROXY在花药发育中的功能,以文心兰‘南茜’（Oncidium Gower Ramsey）为试验材料,从‘南茜’的转录组网站选取一条与拟南芥At ROXY1/2相似度最高的基因序列（命名为OnROXY1）,以该序列的cDNA为模版设计引物,用RT-PCR从‘南茜’花器官中扩增该基因,并对扩增产物进行测序和保守结构域分析.结果表明,OnROXY1基因编码区402 bp,编码133个氨基酸,与‘南茜’转录组网站中的预测序列只有一个碱基差异,但与该预测序列的氨基酸序列和保守结构域完全一致（GenBank登录号：MF696154）.OnROXY1基因具有典型的谷氧还蛋白（Glutaredoxin,GRX）基因家族的结构域和CMCC活性位点,因此该基因属于GRX基因家族,并且属于亚类CC型的GRX基因.进化树分析表明,OnROXY1与水稻的Os ROXY1、Os ROXY2和拟南芥的At ROXY1、At ROXY2蛋白序列的一致性最高,进化距离最近.亚细胞定位结果显示,OnROXY1主要定位于细胞核中,少量定位在细胞质中.RT-PCR检测发现,在不同组织部位中,OnROXY1在假鳞茎中的表达量最高,唇瓣中的表达量最低;不同花期的定量结果显示,OnROXY1在脱落干枯期时的表达量最高,盛开期时的表达量最低.本研究推测谷氧还蛋白基因OnROXY1可能在文心兰假鳞茎与根的发育、消除植物体内过多的活性氧以及延缓文心兰花器官的衰老等方面具有重要作用.

龙眼褪黑素合成途径SNAT、ASMT和COMT家族基因鉴定及表达分析

基于第3代龙眼(Dimocarpus longan)基因组及转录组数据库,对褪黑素合成路径上可能的限速基因SNAT(serotonin N-acetyltransferase)、ASMT(N-acetylserotonin methyltransferase)和COMT(caffeic acid O-methyltransferase)进行基因家族成员鉴定,利用实时荧光定量PCR技术研究其在龙眼体胚早期的表达谱,并研究外源IAA、GA3、MeJA、SA和ABA对龙眼胚性愈伤组织中褪黑素含量的影响,以及褪黑素合成途径相关基因的表达模式。结果显示:龙眼SNAT(DlSNAT)、ASMT(DlASMT)和COMT(DlCOMT)基因家族分别含有2、18和7个成员,蛋白质结构域保守,相同家族的成员之间保守基序相差极小,DlASMT和DlCOMT家族成员高度相似。基于氨基酸序列进行系统进化树分析,龙眼、拟南芥、水稻、小麦、番茄、辣椒和卷柏的SNAT家族可分为3个亚组;ASMT和COMT家族具有高度同源性,共同建树并分为3个亚组。DlSNAT、DlASMT和DlCOMT家族成员的启动子中含有大量响应生长素、赤霉素、茉莉酸甲酯、水杨酸和脱落酸的顺式作用元件。表达谱分析显示,DlASMT和DlCOMT家族成员主要在龙眼不完全胚性紧实结构和球形胚阶段高表达,DlSNAT1和DlSNAT2在龙眼体胚发生早期始终处于高水平表达。用0.1 mmol·L^(-1)IAA处理龙眼胚性愈伤组织,内源褪黑素含量在24 h内显著降低,GA;、MeJA、SA和ABA处理则显著提高了褪黑素含量;同时分析DlSNAT、DlASMT、DlCOMT成员表达情况,内源褪黑素含量变化趋势和DlSNAT表达基本一致。综上,DlSNAT、DlASMT和DlCOMT可能通过影响内源褪黑素的合成参与调控龙眼早期体胚发生。