土壤中产脂肪酶洋葱伯克霍尔德菌的分离与鉴定

洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)在生物防治、生物降解等农业领域有着广泛的应用,它产生的脂肪酶则在有机合成、精细化工等领域潜力巨大。采用改良的TB-T平板筛选法从土壤中初步筛选出300株洋葱伯克霍尔德菌,然后用脂肪酶活性检测平板对300株菌进行筛选,最终获得6株脂肪酶产量高的菌,通过发酵发现6株菌均有较好的产脂肪酶能力。随后通过16S rDNA比对的方法将6株全部鉴定为B.cepacia。在此基础上,采用HaeⅢ-recA RFLP和基因种特异性PCR对6株菌进行了基因种鉴定,结果表明JWT16、G63YL、WJ158和JWT137属于Burkholderia cenocepacia菌,JWP9属于Burkhold-eria vietnamiensis,JWT267则属于Burkholderia multivorans。

胜利河连续系统中蜉蝣优势种的生产量动态和营养基础

大型底栖动物在河流生态系统中发挥着重要作用,2009年3月至2010年3月间对长江中游支流巴河流域的胜利河大型底栖动物群落进行1周年的调查研究。结果表明,主要蜉蝣优势种扁蜉一种、等蜉一种和红斑蜉的生活史为3代/a、3代/a和2代/a。现存量呈现出1—3级河流增加、4级又较3级有所下降的趋势。采用体长频率法(实则size-frequency method)测算的周年生产量分别为:扁蜉,200.13 g.m-.2a-1,P/B为23.69;等蜉,82.06 g.m-.2a-1,P/B为18.12;红斑蜉,12.30 g.m-.2a-1,P/B为8.78。3种蜉蝣生产量时间动态与现存量较一致,但彼此各不相同;扁蜉日均产量于2009年3月在二级河流中达到最大(363.56 mg.m-.2d-1),等蜉于2010年3月在三级河流中到达最大(282.76 mg.m-.2d-1),而红斑蜉于2009年3月在一级河流中到达最大(33.36 mg.m-2.d-1)。生产量的营养基础分析结果表明,3种蜉蝣前肠内含物中无形态碎屑均占最大比例(41.14%—74.37%),其对生产量的贡献率也最大(46.67%—77.15%),其它食物类型均相对较小,且总体上与作者在黑竹冲和叹气沟的研究结果存在一定差异,可能与这些溪流自身环境和地区分布有关。

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌（Burkholderia cepacia）脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G＋C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。