单增李斯特菌内化素家族蛋白Lmo1136生物学特性的研究

单增李斯特菌内化素家族蛋白通常在该菌感染及致病中起重要作用,为探究其内化素家族蛋白Lmo1136在李斯特菌感染致病机制中的作用,本研究以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板,经PCR扩增lmo1136基因的上下游基因片段,经重叠延伸PCR将同源臂连接后与温敏型穿梭质粒pKSV7连接构建重组质粒,利用同源重组技术使重组质粒与EGD-e同源片段发生交换,得到缺失株Δlmo1136并经PCR和测序鉴定;以单增李斯特菌EGD-e基因组为模板,PCR扩增lmo1136基因与启动子片段,并与整合型穿梭质粒pIMK2连接后电转化Δlmo1136感受态细胞,得到回补株CΔlmo1136并经PCR和测序鉴定。将单增李斯特菌EGD-e、Δlmo1136和CΔlmo1136分别接种96孔板,37℃培养12h后测定各菌株OD600nm值,并根据OD600nm值绘制各菌株的生长曲线。结果显示各菌株生长速度无显著差异(P>0.05)。将各菌株以感染复数(MOI)10感染人结直肠腺癌细胞(Caco-2细胞)后30min和90min时收集细胞裂解物,接种于BHI培养基进行单菌落计数,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136的黏附性无显著差异(P>0.05),侵袭力显著下降(P<0.05),而CΔlmo1136的黏附性与侵袭力均无显著差异(P>0.05)。将各菌株均以MOI0.2感染小鼠巨噬细胞(RAW246.7细胞)后2h、5h和8h时收集细胞裂解物接种于BHI培养基,单菌落计数,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136和CΔlmo1136菌落数均无显著差异(P>0.05)。将各菌株均以1×10^(6) cfu/只经腹腔注射小鼠,48 h后取小鼠脾脏与肝脏研磨,接种于BHI培养基进行单菌落计数,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136的菌落数显著下降(P<0.05),CΔlmo1136的菌落数无显著差异(P>0.05)。将各菌株均以1×10^(6)cfu/只经腹腔注射小鼠,每隔24h记录小鼠存活情况,结果显示,与EGD-e相比,Δlmo1136组小鼠存活率显著升高(P<0.05),CΔlmo1136组小鼠的存活率无显著差异(P>0.05)。上述结果首次表明lmo1136缺失后,单增李斯特菌的生长能力、细胞黏附性和胞内增殖能力均无显著变化,但对细胞侵袭力、小鼠脏器定植能力显著降低,小鼠存活率显著升高,阐明了内化素家族蛋白Lmo1136在单增李斯特菌细胞侵袭、脏器定植和对小鼠致病机制中发挥重要作用,本研究上述结果为进一步解析Lmo1136介导细菌的感染机制奠定了重要基础。