基于谷氨酸消旋酶基因(murI)构建杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株的染色体-质粒平衡致死表达系统

【目的】构建一种基于谷氨酸消旋酶(MurI)基因的染色体-质粒平衡致死系统,用于杀香鱼假单胞菌减毒活疫苗株(Pseudomonas plecoglossicidaΔtssD-1,PpΔtssD-1)中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供新的思路和方法。【方法】利用同源重组技术,将亲本株PpΔtssD-1中的murI基因敲除,构建murI基因缺失突变株;将广宿主穿梭质粒pBBR1MCS-2的卡那霉素抗性基因替换为murI基因,构建平衡致死质粒(即无抗性回补质粒);在平衡致死质粒的多克隆位点处插入绿色荧光蛋白以检测外源抗原是否稳定表达,对重组菌株进行生物学特性分析,包括生长曲线、质粒稳定性和外源抗原表达水平。【结果】murI基因缺失株在不含D-谷氨酸的LB培养基上无法生长;无抗性回补株在不含D-谷氨酸的LB培养基上恢复了生长能力,但生长速度低于亲本株;经鉴定外源抗原可在无抗性质粒中稳定表达,并可在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,平衡致死质粒在重组菌株中具有良好的遗传稳定性。【结论】本研究以murI为靶点构建了新型的染色体-质粒平衡致死系统,可在无抗性筛选条件下在PpΔtssD-1中表达外源抗原,为开发多联活疫苗提供了新的策略和方法。

3种典型潮滩沉积物微塑料分离方法研究

针对我国海岸带环境中微塑料监测方法缺乏标准化和系统化问题,探讨和改进了直接浮选法(方法 A)、分液漏斗法(方法 B)和容量瓶法(方法 C)3种典型的潮滩沉积物微塑料检测方法,并探究了沉积物粒径和聚合物类型对其分离效果的影响。经检验,3种方法对潮滩沉积物中尺寸约为1 mm的高密度聚乙烯(HDPE)、聚氯乙烯(PVC)和聚丙烯(PP)等5种常见聚合物颗粒的平均分离效率达到(91±7)%,且聚合物类型并不会影响分离效果(P>0.05)。方法 B在分离效率和稳定性方面明显优于其他2种方法(P<0.05),对于粗砂(0.5~1.0 mm)、粉砂(0.004~0.063 mm)和泥质(<0.004 mm)3类潮滩沉积物中的微塑料颗粒均有着良好的分离(95%±3%)。沉积物粒径会显著影响提取效果,呈现出随着沉积物粒径的增大、微塑料分离效率提高的趋势(P<0.05)。利用方法 B对系列现场调查样品进行了测定,结果显示,海州湾北部绣针河口、赣榆港码头和高公岛乡潮滩沉积物中微塑料数量丰度分别为34.97~144.33 n/kg、43.70~119.9 n/kg和372.98~1 103.02 n/kg;质量浓度分别为2.56~10.70 mg/kg、1.01~5.92 mg/kg和3.36~8.48 mg/kg。

鱼类肌肉组织18S rRNA降解变化与死亡时间的关联性

自我国实施了海洋伏季休渔制度以来,确定市售鱼类的死亡时间成了渔业执法领域的难题。本论文借鉴了法医学研究,探索死亡鱼类肌肉组织中18S核糖体RNA(18s)降解程度来推断死亡时间的可行性。先通过分析在(0~1℃)低温贮存条件下斑马鱼肌肉组织18s的降解动力学,结果表明肌肉组织内18s呈现区域偏好性的时序降解。在此基础上,建立了一种基于逆转录PCR检测多个特定片长18s降解物的技术,推测鱼类死亡时间的方法原型。虽然该方法仍存在局限性,但在1~7 d的死亡后冷藏时间范围内具有可行性。