长柄石杉ISSR-PCR反应体系的建立与正交优化

长柄石杉ISSR反应体系的建立能为利用ISSR标记技术进行长柄石杉品种鉴别、分类、种质资源遗传多样性分析奠定良好基础。利用正交试验设计的方法,从dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、引物浓度和Mg2+浓度4种因素,对长柄石杉ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度进行梯度检测。结果表明,20μLISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为1×PCRbuffer、300μmol/LdNTP、0.2μmol/L引物、2.0mmol/LMg2+、1.75UTaqDNA聚合酶、40ng模板DNA。该优化体系的建立为下一步进行长柄石杉ISSR分子标记奠定了基础。

长柄石杉种质资源圃建设与原生境扦插实验初报

石杉科植物药用价值高,由于过度开采加之难以人工繁殖,导致资源危机。在石杉科植物种质资源圃建设的基础上,进行了长柄石杉原生境林下扦插试验研究,结果表明:原生境土壤是最合适长柄石杉扦插繁殖的基质,其次是全沙基质;春季、秋季对长柄石杉原生境(林下)扦插实验效果的影响不明显;IBA 3个浓度梯度处理中2×10-3处理的效果为最好,生根率、死亡率和平均生根量(条/插穗)表现明显优于其他处理小组;带茎尖的插穗扦插指标大部分优于茎段插穗组,说明带茎尖的插穗应该是长柄石杉扦插育苗插穗首选。

石杉科植物RAPD反应体系的优化

以石杉科新鲜植物为材料,应用改良的CTAB法提取其基因组DNA,通过单因子实验优化了RAPD的反应体系。在25μL反应体系中,Mg2+2.0 mmol/L,dNTPs 0.3 mmol/L,模板DNA3ng/μL,随机引物0.2μmol/L,Taq DNA聚合酶1.25U。PCR循环程序为:94℃预变性5 min;然后94℃变性1 min,39℃退火1 min,72℃延伸1.5 min,36个循环;最后72℃延伸7 min,4℃保存。结果表明该体系具有良好的稳定性和重复性,可应用于石杉科植物系统分类,种的鉴定和遗传多样性研究。

高分子防排水虹吸系统在大型公共建筑领域的应用

随着城市化进程的加速以及建筑业的不断发展,大型公共建筑的建设日益增加。然而,在建筑物的设计、施工和维护过程中,防水排水问题始终是关注的焦点。高分子防排水虹吸系统不仅能够解决排水问题,还能够有效地保护建筑环境。因此,本文将探讨高分子防排水虹吸系统在大型公共建筑领域的应用,旨在为建筑人员提供参考和借鉴。

散发性结直肠癌微卫星不稳定状态与错配修复蛋白表达缺失及临床病理特征的相关性

目的:探讨散发性结直肠癌微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)情况及其与错配修复(mismatch repair,MMR)蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表达缺失的相关性,并总结MSI散发性结直肠癌的临床病理学特征。方法:多重荧光PCR法检测散发性结直肠癌肿瘤组织DNA的微卫星不稳定性,免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)S-P法检测散发性结直肠癌肿瘤组织MLH1、MSH2、MSH6、PMS2蛋白的表达缺失,分析MSI发生与MMR蛋白表达缺失及临床病理特征的相关性。结果:75例散发性结直肠癌检出MSI 21例(28%),包括MSI-H 19例、MSI-L 2例,其他54例(72%)为MSS。检出MMR蛋白表达缺失16例(21.33%),其中15例(93.75%)为MSI-H、1例(6.25%)为MSS;MMR蛋白表达59例(78.67%),其中4例(6.78%)为MSI-H、2例(3.39%)MSI-L,其他53例为MSS。MSI组MMR蛋白缺失率(15/21,71.43%)显著高于MSS组(1/54,1.9%)(P<0.01)。MSI与患者年龄,是否黏液腺癌,肿瘤有无远处转移有关(P<0.01),其中MSI-H好发于年龄>50岁、肿瘤无远处转移、MMR蛋白缺失人群,且类型以黏液腺癌为主。结论:散发性结直肠癌肿瘤组织中MSI发生率高于MMR蛋白缺失率,并且MSI-H的散发性结直肠癌转移风险较低、预后较好。检测MSI状态对提高结直肠癌的预防、诊断和治疗水平,降低结直肠癌的发病率和病死率有着重要意义。

重组PACAP衍生物RMBYLL的高效制备及其体外生物学效应

为了利用基因工程技术高效制备具有治疗Ⅱ型糖尿病功能的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)衍生物RMBYLL,并在体外研究其生物学效应,采用基因重组技术表达重组肽RMBYLL,纯化、制备并鉴定重组肽RMBYLL后,利用特定细胞系和Western-blot等技术,检测RMBYLL对VPAC1、VPAC2和PAC1受体的选择性和激动活性,以及重组肽RMBYLL对胰岛素受体介导的信号传导最终效应物—葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达的影响。实验结果表明:利用重组肽技术制备的RMBYLL的M_r为3.901k,纯度大于95%,其产率为18.7 mg/(L发酵产物);制备的RMBYLL可与VPAC2受体特异结合并显著促进VPAC2-CHO细胞cAMP的产生,其受体半激活浓度(EC_(50))为0.90 nmol/L,目的肽RMBYLL可显著增强3T3-L1脂肪细胞GLUT4的表达,阳性实验组是对照组的1.91倍。由此表明,利用本研究确立的表达、纯化策略可实现高活性RMBYLL的高效制备,应用前期构建的含有特定受体的CHO细胞和3T3-L1脂肪细胞模型,可方便有效地进行相关药物肽的体外生物学效应研究。

重组TNF-α衍生物RMPT的制备及其抗肿瘤作用初步研究

利用基因重组技术制备具有抗肿瘤作用的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)衍生多肽RMPT,并研究其体外生物学效应。PCR方法合成RMPT基因序列,定向插入高效表达载体pTXB1-MCS,在大肠杆菌ER2566中诱导表达重组融合蛋白并建立RMPT融合蛋白诱导表达的优化体系。N端自动切割、纯化、HPLC制备获得RMPT,电泳和质谱鉴定其分子质量。CCK-8检测RMPT对肿瘤细胞的抑制作用。实验结果表明:重组工程菌可溶性RMPT融合蛋白最佳诱导表达条件为37℃、8 h、IPTG浓度0.75 mmol/L;DTT诱导蛋白内含肽自剪切固相纯化和HPLC制备重组肽RMPT,纯度大于95%,电泳和质谱鉴定其分子质量为3.7 ku,结果与理论值相符合,其产率为10.8 mg/L发酵液;体外研究表明,RMPT能够高效抑制多数肿瘤细胞增殖。

垂体腺苷酸环化酶激活肽衍生多肽RHMP的重组制备及促角膜损伤修复的初步研究

利用基因工程技术高效制备具有促进角膜损伤修复功能的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)衍生多肽RHMP,并在体外研究其生物学效应,为角膜疾病的治疗提供了新思路。采用基因重组技术表达重组肽RHMP,经Chitin-Beads柱纯化、HPLC及SDS-PAGE、质谱鉴定后,研究其对小鼠角膜损伤修复的影响。实验结果表明:利用基因重组技术制备的PACAP衍生多肽RHMP的分子量为3.4kDa,纯度为96%;将重组肽作用于创伤后的小鼠角膜,12h、24h、36h、48h后角膜修复率分别为(49.58±1.74)%、(93.66±3.39)%、(99.6±0.43)%、(99.8±0.14)%,而对照组修复率分别为(9.76±1.58)%、(29.02±1.63)%、(55.10±1.49)%、(78.59±2.52)%,P<0.001,差异具有统计学意义,重组肽RHMP可显著促进小鼠角膜损伤修复。因此,利用以上确立的表达、纯化策略,可实现新型基因重组PACAP衍生多肽RHMP的高效制备,重组多肽RHMP可快速有效地促进损伤角膜的修复,从而有望成为一种新型角膜损伤治疗药物;同时,建立的小鼠角膜上皮损伤模型可用于相关药物的生物学效应研究。

PACAP衍生多肽RDB的高效制备及其改善胰岛素抵抗作用的初步研究

为了制备垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)衍生多肽RDB并初步研究其改善脂肪细胞胰岛素抵抗的作用,利用基因工程技术,选用大肠杆菌偏爱密码子,以重叠延伸PCR方法合成RDB基因序列,定向插入到高效表达载体pKYB-MCS中,用大肠杆菌ER2566进行表达,融合蛋白经Chitin-Beads柱纯化后,利用β-巯基乙醇诱导蛋白内含肽的N端自剪切,释放目的肽,再用HPLC制备纯度较高的PACAP衍生多肽RDB,实现RDB的高效制备;利用制备的重组肽RDB研究其对胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的改善作用及初步机制。制备的重组肽RDB的Mr为3.990 k,纯度大于95%,其产率为17.3 mg/L发酵产物;制备的RDB可明显促进胰岛素抵抗的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖利用及信号分子IRS-1的表达。结果表明在确立的优化条件下可高效制备纯度较高的PACAP衍生多肽RDB(纯度≥95%),RDB能改善胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性,其作用机制与胰岛素信号通路相关蛋白的表达有关。