轻链单个氨基酸改变可增强新冠病毒嵌合抗体的中和能力

目的·筛选对新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)具有中和能力的人鼠嵌合抗体,并分析其轻链上的关键氨基酸位点变化。方法·以SARS-CoV-2刺突蛋白作为免疫原,免疫抗体重链基因人源化的小鼠,通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和假病毒中和实验检测小鼠血清抗体水平,应用流式细胞术分选小鼠脾脏和淋巴结中的浆细胞和生发中心(germinal center,GC)B细胞并分析各类B细胞比例。提取细胞的RNA构建鼠源抗体轻链基因文库,与固定的人源抗体重链基因配对表达抗体,并采用ELISA筛选高亲和力嵌合抗体。与鼠源胚系抗体轻链基因比对,分析高亲和力嵌合抗体轻链的氨基酸变化位点。分别构建并表达轻链单个氨基酸位点改变的嵌合抗体,通过ELISA和假病毒中和实验检测其亲和力及中和能力;比较上述位点改变前后嵌合抗体的亲和力及中和能力,并分析具有关键作用的氨基酸位点变化。结果·与未免疫小鼠相比,免疫后小鼠血清中针对SARS-CoV-2的特异性抗体的滴度增加,脾脏和淋巴结中的浆细胞和GC B细胞的比例亦有增加。ELISA的结果显示,从小鼠脾脏的GC B细胞中筛选到具有高亲和力的嵌合抗体。该抗体轻链的第76位苏氨酸替换成了异亮氨酸,且第98位苯丙氨酸发生缺失。随后,ELISA结果显示,该嵌合抗体具有较强的亲和力,轻链氨基酸没有变化的抗体和轻链仅携带第98位氨基酸缺失的抗体的亲和力较弱,而轻链仅携带第76位氨基酸替换的抗体的亲和力介于嵌合抗体和轻链氨基酸没有变化的抗体之间。假病毒中和实验的结果显示,该嵌合抗体的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为0.995 ng/μL;轻链仅携带第76位氨基酸替换的抗体的IC_(50)为1.724 ng/μL,中和能力有所减弱;轻链仅携带第98位氨基酸缺失的抗体的IC_(50)为71.05 ng/μL,轻链氨基酸没有变化的抗体的IC_(50)为42.06 ng/μL,中和能力均较弱。结论·成功筛选得到对SARS-CoV-2具有中和能力的人鼠嵌合抗体,且该抗体轻链上第76位苏氨酸替换为异亮氨酸是决定其中和能力的关键。

抗体基因点突变、插入和缺失体外检测方法的建立及应用

目的·建立由激活诱导胞苷脱氨酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)引起的体细胞高频突变过程中,快速检测抗体基因可变(variable,V)、多样(diversity,D)、连接(joining,J)区发生突变(包括点突变、插入和缺失事件)的体外方法。应用该方法检测经2种DNA聚合酶β(polymeraseβ,Polβ)抑制剂处理的细胞中抗体基因VDJ片段的突变情况。方法·用慢病毒感染法处理CH12F3细胞(即处理组),感染前的CH12F3细胞为对照组。采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测2组细胞中AID的表达水平。构建高通量测序文库,应用生物信息学的方法分析处理组和对照组细胞中抗体基因VDJ片段的点突变、插入及缺失频率。采用不同浓度的Polβ抑制剂[扎西他滨(2’,3’-dideoxycytidine,DDC)、5-甲氧基黄铜(5-methoxyflavone,5-MF)]处理CH12F3细胞,并采用台盼蓝拒染法测定该2种抑制剂对细胞增殖的影响。分别以筛选得到的DDC浓度、5-MF浓度处理CH12F3细胞(即实验组),以0.9%NaCl处理的细胞及DMSO处理的细胞依次记为上述实验组的对照组,使用上述已建立的方法进行处理,最终行高通量测序,分析该2种抑制剂对抗体基因VDJ片段中点突变、插入及缺失频率的影响。结果·Western blotting结果显示,和CH12F3细胞对照组相比,CH12F3细胞处理组中AID表达较高;且高通量测序结果显示,该组在抗体基因VDJ片段上存在大量的点突变,且插入和缺失的频率均较高(均P=0.000)。台盼蓝拒染法检测显示,处理CH12F3细胞最适宜的DDC浓度为100μmol/L、5-MF浓度为25μmol/L。最终的高通量测序结果显示,和0.9%NaCl对照组相比,经100μmol/L DDC处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度为1 bp的缺失频率亦较低(P=0.009);和DMSO对照组相比,经25μmol/L 5-MF处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低(P=0.000),长度大于1 bp的插入和缺失频率亦有所下降(均P=0.000)。结论·该研究建立的体外检测方法可用于分析AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件。Polβ抑制剂DDC和5-MF对由AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件具有抑制作用。