计划免疫后出生献血者乙肝无症状慢性感染血清学与分子生物学特征分析

目的了解深圳地区计划免疫后出生献血者乙肝病毒无症状慢性感染情况,分析其血清学和分子生物学特征。方法将1992年之后出生的无偿献血者的HBsAg ELISA阳性血液标本进行乙肝两对半检测和核酸大容量提取,对其BCP/PC区及S区进行巢式PCR扩增及qPCR定量检测,并对产物进行基因测序及序列分析。结果2020年12月—2022年1月共收集46632份计划免疫后出生无偿献血者标本,其中含男性31612份,女性15020份。通过常规筛查得到ELISA阳性标本99份,经化学发光、巢式PCR、实时荧光PCR等方法检测,61份确证HBsAg阳性,阳性率0.13%(61/46632)。其中男性49份,阳性率0.16%,女性12份,阳性率0.08%(P<0.05)。50/61份标本获得S序列,经系统进化树分析,其中B型46份[92%(46/50),男性38份,女性8份],C型4份[8%(4/50),男性3份,女性1份]。S区突变频率高的分别N40S(8/46,17.39%),G44E(7/46,15.22%),Q129H/R(6/46,13.04%),Y161F/S(7/46,15.22%),V179A(4/46,8.70%),S53L(2/4,50%),C69T(2/4,50%),I126S/T(2/4,50%)。其中免疫逃逸突变有Q129R和T/I126A/N/S/T。结论乙肝疫苗接种能大大降低献血者的乙肝表面抗原阳性率,提高输血安全性。高频率的免疫逃逸突变也成为血液安全潜在风险,需要进一步探讨研究。

献血者血液乙肝病毒血清学和核酸筛查成本效益分析

目的 为减少输血乙肝残余风险,对献血者血液乙肝病毒血清学HBsAg筛查、HBsAg+核酸单人份及HBsAg+核酸混样筛查策略的成本效益情况进行分析。方法 基于实际检测数据,根据已发表的文献确定各种参数,预测不同筛查策略下阻止窗口期感染、慢性感染及隐匿性感染的人数,计算血液乙肝病毒血清学和核酸筛查成本效益。结果 132 208份血样核酸单人份HBsAg-/HBV DNA+检出率(0.11%)高于混样检出率(0.058%)(P<0.05)。应用单人份乙肝核酸检测可阻止输血传播乙肝的病例数是混样筛查1.25倍,取得的效益亦是混样筛查1.25倍。HBsAg、HBsAg+核酸单人份及HBsAg+混样核酸3种筛查方法成本效益为1∶63.6、1∶28.6和1∶53.4。结论 血液乙肝HBsAg组合单人份核酸筛查具有最高的效益。HBV筛查应尽可能采用单人份核酸检测策略,以提高输血安全性。

核酸扩增技术在献血者血液HBV DNA、HCV RNA及HIV-1 RNA筛查中的应用研究

目的探讨在我国无偿献血者的血液筛查中引进核酸扩增技术(NAT)的必要性,了解献血者血清学病毒标志物检测阴性、NAT检测阳性的感染状况。方法应用Roche PCR、PCR-微流芯片、实时荧光PCR方法对深圳市131 174人(次)血清学检测病毒标志物阴性的献血者进行HBV DNA、HCV RNA和HIV-1 RNA检测,对NAT阳性献血者追踪检测并做定量分析。结果HBV DNA阳性22例,阳性率为1/5 962,其中15例为抗-HBc阳性,阳性率为1/8 745;HCV RNA阳性1例,阳性率1/131 174;HIV-1 RNA未检出阳性。对14名HBV DNA阳性者的追踪发现,8人发生了血清转换现象。结论采用高灵敏度的NAT筛查献血者血液中的HBV和HCV,有助于提高输血及血液安全。

血液HBV全自动核酸筛查方法的应用研究

目的:探讨在加样仪上实现血液样本汇集,在RocheMPLC上全自动提取样本HBVDNA ,在COBASAM PLICOR上进行扩增和检测的方法,为血液HBV全自动核酸筛查提供应用依据。方法:在酶联免疫吸附实验(ELISA)筛查血液基础上,应用STAR2 0 0 0加样仪自编程序进行全自动血样汇集( 2 4人份) ,在MPLC上全自动方法提了样本核酸,应用PCR方法在COBASAMPLICOR进行扩增和检测分析结果,从检出限量及抗干扰能力方面进行考评。结果:用国际标准核酸质控品考评及深圳应用,表明全自动汇集,全自动核酸提取及扩增和检测HBVDNA 95 %检出限量为3 8.9IU/ml,95 %CI为2 1～3 2 3 ,2 0mg/dl胆红素、Ig/dl血色素及中等程度的脂血对结果无影响。通过对16 5 12个样本共688个汇集池分析,HBVDNA阳性8例,阳性率为0.0 4 9%。

核心抗体阳性合格献血者隐匿性乙肝病毒感染分子生物学特性及追踪结果的研究

目的了解我国核心抗体阳性合格献血者隐匿性乙肝病毒感染(OBI)情况,分析血清学和分子生物性特征。方法对HBs Ag(-)、NAT检测无反应性的合格献血者血浆,进行乙肝两对半检测和anti-HBs定量检测,对核心抗体阳性标本进行病毒核酸提取,和BCP/PC区及S区巢式PCR扩增,对扩增结果阳性产物纯化后进行基因测序及序列分析,同时进行QPCR定量检测。对HBV DNA阳性的献血者进行追踪检测和分析。结果在1 033名合格献血者中,抗-HBc(+)占47.4%,阳性率随年龄的增长而增加(P<0.001),30岁以下年龄组为32.6%而到50岁以上年龄组为为69.8%。777/1033为抗-HBs(+),占75.2%。在抗-HBc(+)人群中共检出14例HBV DNA(+),其中7例抗-HBs滴度在100 IU/L以上,在抗-HBc(+)合格献血者中OBI阳性率为2.86%。8/14例OBI为B型,1例为C型。7/14能追踪的标本中,1例发现抗-HBe血清转换为阳性。所有追踪标本的病毒均变成检不出。5例BCP/PC区序列发生突变,3例S区氨基酸变异。结论经HBs Ag及NAT检测合格的抗-HBc(+)献血者,其血液中仍有一定几率含有HBV DNA,存在经输血传播病毒的威胁,提示在乙肝高流行地区需进一步提高核酸检测方法的灵敏度,必要时可增加抗-HBc的检测。

自动化核酸扩增技术(NAT)在血液筛查中的应用研究

目的为了提高血液安全性,探讨自动化核酸扩增技术在血站血液筛查中应用的可行性。方法在酶联免疫试验(ELISA)常规筛查血液的基础上,应用STAR2000加样仪自编程序进行全自动血样汇集(8人份),在KHB-DP1000半自动核酸提取仪上自动化方法提取样本核酸,应用荧光PCR方法在AB I7300上进行扩增和检测分析结果,用临检中心室间质控品和澳大利亚室间质控品进行室间质评,用标准品考评检测限量。结果应用标准品考评检测限量,本法的95%的检出限量HBV DNA、HCV RNA和H IV RNA分别为100.9 IU/m l,155.1拷贝/m l和165拷贝/m l,95%可信限范围分别为(60.1、302.2),(98.9,398.6)和(105.2,425.8)。通过对16 744个样本共2093汇集池检测,初始检测HBV DNA阳性池2个,HCV RNA、H IV RNA未检出阳性池,进一步拆分检测,有2份献血者的血液HBV DNA阳性,HBV DNA阳性率为0.012%。结论随着国内相关技术的不断提高和相关制度的不断完善,可以考虑将国产自动化核酸扩增试剂纳入血站血液常规筛查。

深圳市18～25岁抗-HBc阳性合格献血者隐匿性乙肝病毒感染的血清学和分子生物学特性分析

目的了解深圳市18～25岁抗-HBc阳性合格献血者隐匿性乙肝病毒感染情况,分析血清学和分子生物性特征。方法对HBs Ag（-）、NAT检测无反应性的18～25岁合格献血者血浆进行乙肝两对半检测和抗-HBs定量检测,对抗-HBc阳性标本进行病毒核酸提取和BCP/PC区及S区巢式PCR扩增,对扩增结果阳性产物纯化后进行基因测序及序列分析,同时进行QPCR定量检测。结果在889名18～25岁HBs Ag（-）、NAT检测无反应性的合格献血者中,抗-HBc（＋）共231名,占总人数25.98%（231/889）,其中18～21岁组70名,占该组19.72%（70/355）,22～25岁组161名,占该组30.15%（160/534）;抗-HBs（＋）共568名,占总人数63.89%（568/889）,其中18～21岁组218名,占该组61.41%（218/355）,22～25岁组350名,占该组65.54%（350/534）;对197例抗-HBc（＋）标本利用巢式PCR对HBV S区及BCP/PC区扩增,2例S区阳性,占1.02%（2/197）,5例BCP区阳性,占2.54%（5/197）,且均属于22～25岁组。对S区阳性PCR产物测序,发现2例均为B型,DNA序列与野生型相比,1例在532号位点由T变异为G,即T532G,氨基酸序列未发生变异。另1例氨基酸序列发生E44U变异。结论经HBs Ag及NAT检测合格的抗-HBc（＋）献血者,其血液中仍有一定几率含有HBV DNA,需进一步提高核酸检测方法的灵敏度。

PCR-微流芯片在血液HBV DNA HCV/HIV RNA筛查中的初步应用

目的探讨在血液筛查中应用PCR-微流芯片技术检测献血者HBV DNA,HCV/HIV RNA的模式及可行性。方法在常规ELISA初、复检全项测定合格基础上,将献血者的血清按5人份×200μL进行汇集,用大容量磁珠法提取样本核酸,PCR-微流芯片检测技术进行扩增和检测。将国家标准质控血清进行系列稀释考评方法的灵敏度和重复性。结果342份(69个汇集池)无偿献血标本中有3份HBsAg(-)HBV DNA(+),HBV DNA阳性率为0.89%,其中1份标本两对半结果全阴性,2份标本抗-HBs(+)及抗-HBc(+)。PCR-微流芯片法检测HBV DNA、HCV RNA及HIV RNA的95%的灵敏度分别为11.5IU/mL、167.7拷贝/mL和57.9IU/mL结论PCR-微流芯片法具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强、重复性好特点,可应用于血液HBV DNA HCV/HIV RNA的筛查工作,以进一步提高输血的安全性。

实时荧光PCR检测HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液中HBV DNA研究

目的对乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阴性、乙型肝炎核心抗体（抗HBc）阳性的献血者血液进行经输血传播乙型肝炎病毒（HBV）的风险评估，为完善HBV血液筛查模式及确保临床用血安全提供依据。方法对献血者血液常规检测阴性的标本进行8×45μL汇集，应用实时荧光聚合酶链反应（PCR）进行混样核酸检测HBVDNA。对血液常规筛查和混样核酸检测合格的标本，进行随机乙型肝炎血清学5项标志物的酶联免疫吸附试验（ELISA）。对获得的HBsAg阴性、混样HBVDNA阴性、抗HBc阳性的标本，进一步采用单份样本（720μL）实时荧光PCR法检测并定量分析。结果混样标本共检测12552份，检出HBsAg阴性、HBVDNA阳性标本2份，阳性率为0．02％。随机筛查混样核酸检测阴性标本614份，检出抗HBc阳性标本320份，对此320份标本进行单份核酸检测，检出阳性标本1份，阳性率为0．31％。结论HBsAg阴性、抗HBc阳性献血者血液存在输血传播HBV的风险，应用核酸扩增技术检测血液HBVDNA能大大提高血液安全性。

对HBsAg阴性无偿献血乙型肝炎感染者的追踪研究

目的了解和分析HBsAg阴性无偿献血者乙型肝炎感染状况。方法应用罗氏聚合酶链反应（PCR）定量检测方法追踪6位HBsAg阴性，DNA阳性感染者的病毒载量，同时对进行基因分型、血清转换及ALT等多项指标的的动态追踪分析观察。结果6例阳性样本经过至少40d追踪发现，3例发生了血清转换现象；DNA定量追踪分析表明，病毒载量在（35～1．8）×10^4拷贝／ml之间，1例为急性乙型肝炎感染，病毒载量峰值为1．8×10^4拷贝／ml，3例呈低水平携带状态，病毒载量在100～500拷贝／ml之间波动；1例病毒载量下降至检不出，而HBsAg转换成阳性；最后1例间或能检出病毒，载量〈100拷贝／ml。结论本实验结果认为有必要进行献血者HBV核酸筛查工作，进一步提高输血安全性。

国产核酸扩增(PCR)试剂在献血者血液HBV DNA筛查中的应用研究

目的为了提高输血安全性,探讨国产核酸扩增试剂在血站血液乙型肝炎病毒(HBV)筛查中应用的可行性。方法在酶联免疫吸附试验(ELISA)常规筛查血液乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的基础上,采用荧光聚合酶链反应(PCR)技术(国产核酸扩增试剂)对初、复检合格的献血者的血清汇集标本(8人份×150μL)进行HBV DNA检测,对初始反应阳性的汇集标本拆分后再进行单份检测,用国家标准质控品考评检测限量,用已知HBV DNA阳性血样评估检出情况。结果应用国家HBVDNA标准品考评,本方法的95%检测限量为98.0IU/mL,可信限范围为[55.8,548]。对9611份标本共1208个汇集池进行检测,初始检测阳性池7个,阳性率为0.58%,进一步拆分检测,未检出HBV DNA阳性标本;对检测阴性的汇集标本随机进行234份单份检测(1400μL上样浓缩),亦未检出HBV DNA阳性标本。结论同国际知名核酸检测试剂相比,国产核酸扩增试剂的灵敏度和特异性有待进一步提高。

血液HBV DNA全自动检测及基因分型分析

目的建立血液HBVDNA标本汇集、核酸提取、扩增及检测的全自动筛查模式,对阳性标本进行基因分型和血清学追踪检测,为血液HBVDNA自动化筛查提供科学依据。方法在酶联免疫吸附试验(ELISA)筛查血液基础上,应用STAR2000加样仪自编程序进行全自动血样汇集(24人份),在MPLC仪上全自动提取标本核酸,应用PCR方法在COBASAMPLICOR进行扩增和检测分析结果,用国际标准核酸质控品考评检出限量,对阳性标本进行基因分型并追踪血清转换过程。结果全自动汇集、全自动核酸提取和扩增及检测HBVDNA95%检出限量为38.9IU/ml,95%CI为(21323)。通过对16512个标本共688个汇集池分析,HBVDNA阳性8例,阳性率为0.049%。其中C型3人,B型2人,D型1人,2人未能确定基因型,6例阳性标本追踪发现,3例发生了血清转换现象。结论HBVDNA全自动核酸检测方法可应用于24人份血液混样核酸筛查。

献血者HBsAg阴性NAT可疑结果标本乙肝感染状况的调查分析

目的了解献血者应用ULTRIO PLUS核酸检测(NAT)后,初始反应性,鉴别实验阴性(NAT可疑结果)标本HBV DNA感染情况,分析其血清学和分子生物学特征,提高输血安全性。方法本中心2017年1—12月的97 577人(份)无偿献血者标本经常规和NAT检测后,收集HBsAg ELISA(-)/HBV DNA可疑标本,进行乙肝两对半检测与HBV DNA大容量提取,采用巢氏PCR方法扩增BCP/PC和S区基因序列,并对所得序列做基因型分析,同时采用实时荧光定量PCR检测(qPCR)和分析。结果 97 577(人)份献血者标本,通过ELISA和NAT初筛检出205(0.21%)份NAT可疑标本,经血清学、巢氏PCR和qPCR检测,93/205(45.4%)确证HBV DNA阳性, 92/93(98.9%)为隐匿性乙肝感染(OBI)标本。病毒定量范围(5—65.2)IU/mL,中位数为8.1 IU/mL。在可分型的35例标本中,HBV基因型B型18例(51.4%)、C型17例(48.6%)。结论 NAT可疑标本中仍能检出近半数标本为HBV DNA阳性,应提高目前NAT检测灵敏度,确保输血安全。

深圳市无偿献血血液筛查结果分析

目的 :了解深圳无偿献血输血感染性疾病真实感染情况。方法 :采用血清学实验 EL ISA (酶联免疫吸附试验 )、 RIBA (重组免疫印迹试验 )、 WB (免疫印迹试验 )、 TRU ST (甲苯胺红不加热血清试验 )、 TPHA (梅毒螺旋体血凝试验 )和中和实验及分子生物学实验 PCR (聚合酶链反应 )进行血液初筛和对阳性结果进行确证分析。结果 :深圳市无偿献血输血感染性疾病 HBV、抗 - HCV、抗 - HIV和梅毒流行率分别为 0 .79%、 0 .0 92 %、 4 .4 5 / 10万和 0 .6 3%。结论 :应提高目前试剂的特异性和灵敏度 ,进一步确保输血安全。

献血者 HBsAg ELISA弱阳性NAT阴性标本的乙肝感染确证研究

目的调查深圳市无偿献血者HBsAg弱阳性NAT-HBV感染情况,分析血清学和分子生物学特征,探讨形成的分子机制。方法收集HBsAg弱阳性NAT阴性标本,用雅培化学发光微粒子免疫法(CMIA)和中和试验检测HBsAg,用罗氏电化学发光免疫法(ECLI)检测乙肝两对半,采用大容量提取巢式PCR扩增病毒BCP/PC和S区,分析HBV序列。同时进行病毒载量qPCR测定。结果109 752份血样中有104(0.095%)份HBsAg弱阳性NAT阴性血液标本参与本研究。由CMIA和ECLI确证为HBsAg+的有33例(31.7%),包括30例(90.9%)HBV DNA+。HBsAg阳性浓度与HBV DNA载量间成很弱相关性(R^2为0.4187)。在18个可分型的标本中,B型占88.9%,C型和D型仅检出1例(5.6%)。在S基因区发现Q129H,M133L/S/T,T143M、L175S和V177A影响HBsAg检测的高频变异。结论献血者HBsAg弱阳性NAT阴性标本中确有一定比例为乙肝病毒感染。有必要在血液筛查中应用灵敏度更高的HBsAg和NAT检测方法。

深圳地区无偿献血HBsAg阳性感染者的血清学和分子生物学特征分析

目的了解深圳市无偿献血者乙肝病毒感染情况,分析其血清学和分子生物学特征。方法将收集到的确证HBs Ag(+)无偿献血者标本分为/NAT(+)和NAT(-)两组,进行乙肝两对半检测以及病毒核酸大容量提取,采用巢氏PCR方法扩增BCP/PC和S区基因序列,对所得的序列进行分析。结果在42 297份血液中235份HBs Ag确证为阳性的标本,HBs Ag阳性率为0.56%,其中NAT(+)162份,占总数68.9%,NAT(-)为73份,占31.1%,血清学模式以HBs Ag(+)、抗-HBe(+)、抗-HBc(+)为主,占69.78%,检出10例抗-HBc(-)标本,占总数的4.25%。在可测序166标本中,B基因型所占88%(146/166),C基因型占11.4%(19/166),D基因型在HBs Ag(+)/NAT(+)出现1例。结论 NAT检测与HBs Ag检测方法均只能检出部分乙肝感染献血者,血液检测必须结合两种检测方法来保证血液安全。数据显示有必要应用灵敏度更高的NAT检测方法。

应用甲基橙比色法测试加样器的精度

目的 建立适合各级实验室的加样器精度的测定方法。方法 设计用经校正的加样枪在微板上加注特定浓度的甲基橙混合液 ,建立标准曲线 ,同加样器加液进行比较 ,并利用酶标仪进行双波长比色 ,从而检测加液精度。结果 甲基橙比色法同称重法进行统计分析 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。经在全自动加样仪和酶免分析仪上应用表明 ,甲基橙比色法方便、简单、快速 ,且需要的设备要求不高 ,能在各级实验室实施应用。结论 甲基橙比色法可作为单位内部的一种加样器容量精度的检测方法。

计划免疫前后出生的献血者HBV DNA阳性状况及其HBV感染的血清学和分子病毒学特征分析

目的了解深圳市在计划免疫前后出生的无偿献血者HBV感染情况,分析其血清学和分子生物学特征。方法将本中心2016年2-6月收集的26 320人(份)无偿献血者标本,以1992年为界分为计划免疫前出生组组:19 898人(份),年龄18-<24岁;计划免疫后出生组:6 422人(份),24-55岁。分别将每组再分为HBs Ag(+)/HBV DNA(+)、HBs Ag(+)/HBV DNA(-)、HBs Ag(-)/HBV DNA(+)和HBs Ag(-)/HBV DNA可疑(NAT初筛阳性、鉴定试验阴性)4种类型,做"乙肝两对半"检测与HBV DNA小容量和大容量提取,采用巢氏PCR方法扩增BCP/PC和S区基因序列,并对所得序列做基因型分析,同时采用实时荧光定量PCR检测(q PCR)和分析。结果本组26 320(人)份献血者标本,通过酶免方法初筛检出242例HBs Ag不合格标本,经NAT、巢氏-PCR和q PCR检测HBV DNA阳性率为0.741%(195/26 320),其中195名HBV阳性者里有164(130+34)人为初次献血者。计划免疫前后出生2组中初次献血者的HBV DNA阳性率分别为1.309%(130/9 929)vs 0.707%(34/4 810)(P<0.05);隐匿性乙肝感染(OBI)阳性率分别为0.256%(51/19 898)vs 0.093%(6/6 422)(P<0.05)。在可分型的120例标本中,HBV基因型B型95例、C型25例,2种基因型在2组间(74/19 vs 21/6)的分布无明显差异(P>0.05)。结论乙肝疫苗的接种明显降低了献血人群HBV感染的风险,有益于输血安全保障的提高。