琥珀酸发酵过程中固定CO_2的研究进展

随着全球温室效应问题日趋严峻,如何实现CO2的减排成为当今社会各界关注的焦点。本文以琥珀酸发酵过程中固定CO2为出发点,通过CO2固定产生琥珀酸的微生物及产琥珀酸的原理、CO2固定过程优化以及对CO2固定过程的基因改造等方面概述了琥珀酸发酵过程中固定CO2的研究进展。同时指出,基因工程改造将会成为以后研究的重心。考虑到实际应用过程中放大的重要性,在琥珀酸发酵过程中固定CO2的反应条件优化对于与其它发酵产CO2的过程的耦合也将显得日益重要,应加强这一方面的研究。

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育

以Actinobacillus succinogenes NJ113为出发菌株,经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含8～20 g/L硫酸铵平板中筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含8 g/L硫酸铵培养基中厌氧发酵,琥珀酸产量达32.68 g/L,比出发菌提高了180.5%,对葡萄糖收率达65.4%,副产物乙酸、甲酸产量分别下降3.5%、28.7%,琥珀酸/乙酸比值由0.63提高到2.5。在7.5 L发酵罐中,用氨水调节pH分批实验,发酵34 h琥珀酸产量达27.13 g/L,较出发菌株提高了85.3%。

重组溶葡萄球菌酶成品蛋白含量测定方法的建立

重组溶葡萄球菌酶(recombinant lysostaphin,rLysn)对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性,是一种新型抗菌药物,含有该酶的药用制剂在临床上能有效控制金葡菌感染。为在rLysn成品中增加蛋白含量测定以控制制剂的质量,建立了成品中rLysn蛋白含量测定方法,并进行验证。采用体积排阻高效液相色谱法(size exclusion high performance liquid chromatograph,SEHPLC)测定rLysn理化对照品及成品蛋白质含量。色谱柱:TSK gel 2000SWXL(7.8 mm×30 cm,5μm);流动相:20 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)+0.3 mol/L NaCl;流速:0.5 mL/min;柱温:25℃;检测波长:280 nm。结果显示,rLysn在2-32μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(r2=1);低、中、高3种浓度的rLysn理化对照品空白加标平均回收率为102.9%,成品加标平均回收率为102.1%;3种不同上样量在不同时间内测定,蛋白含量RSD<1%;每隔1 h测定同一支供试品溶液,蛋白含量RSD为0.98%;同一批供试品溶液取6份进样,蛋白含量RSD为1.71%。实验结果表明,采用SE-HPLC方法简便,准确性、精密度、稳定性及重复性好,可用于rLysn成品蛋白质含量的测定。

重组溶葡萄球菌酶泡腾栓在母猪体内的药动学与阴道内残留消除研究

通过双抗夹心酶联免疫学方法,采用药代动力学软件3p97,分别在健康和患阴道炎猪体进行重组溶葡萄球菌酶(rLSP)药代动力学及阴道黏液中活性研究分析,对静脉注射rLSP的药物浓度-时间数据进行最佳模型拟合。结果表明,健康和患阴道炎母猪经静脉注射rLSP(400U)后,消除半衰期分别为36.10分钟和40.36分钟。健康和患阴道炎母猪经阴道给药rLSP泡腾栓(400U)后,试验母猪血液中均未检测到酶活性,说明rLSP经阴道内黏膜吸收后在血液中没有药物蓄积。健康母猪和患病母猪在给药后36小时阴道内黏液中均能检测到酶活性(分别为7.34ng/mL和4.45ng/mL),而在第48小时均未检出,表明该药物在阴道内至少保持36小时的活性,且作用48小时后无残留。

宫溯康预防奶牛产后子宫内膜炎的临床试验

为研究宫溯康对奶牛产后子宫内膜炎的临床预防效果,本试验选择分娩后胎衣自下的奶牛,试验分为预防组和对照组。预防组奶牛从分娩后24～36h通过消毒过的专用投药器投入3粒宫溯康至奶牛子宫孕角深部;对照组产后子宫不做任何处理。结果表明,试验组奶牛急性子宫内膜炎的发病率为5.3%,而对照组急性子宫内膜炎的发病发病率为24.3%,其发病率显著高于试验组(P<0.05)。宫溯康能显著降低产后奶牛子宫内膜炎的发病率,具有很好的临床应用前景。

耐铵型产琥珀酸放线杆菌的选育及铵离子对其生长代谢的影响

经硫酸二乙酯(DES)诱变,在含61～242mmol/LNH4+梯度平板中,筛选到一株耐铵型突变株YZ25,该菌株在含121mmol/LNH4+发酵培养基中,琥珀酸产量达32.68g/L,转化率为65.4%,比出发菌提高了180.5%。进一步考察了不同形态铵盐对YZ25生长的影响,结果表明添加少量铵盐能够提高突变菌的生长速率,但当超过一定量后菌株生长受到抑制,不同铵盐对菌株的抑制程度不同,硫酸铵、碳酸氢铵、氯化铵和硝酸铵对突变株YZ25的半抑制浓度分别为:215mmol/L、265mmol/L、235mmol/L、210mmol/L。为了考察铵离子对YZ25发酵产琥珀酸的影响过程,在3.0L发酵罐以氨水作为pH的调控剂发酵,结果表明在稳定期前菌株生长基本不受铵离子抑制,生物量能够达到正常水平,但是进入稳定期后铵离子抑制作用越来越明显,导致菌株生长提前结束,耗糖不完全,产酸受阻。最后结合产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes代谢途径分析了铵离子对菌株抑制作用的机理。

不同pH调节剂对产琥珀酸放线杆菌NJ113发酵产丁二酸的影响

在3L发酵罐中分别采用不同的碱性物质作为pH调节剂,考察其对产琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes NJ113厌氧发酵制备丁二酸的影响。结果表明:Ca2+、NH4+调节剂对菌体生长代谢有较大阻碍作用,丁二酸产量较低;采用含Na+调节剂,在发酵中后期菌体出现絮凝现象严重,且产丁二酸能力骤降;采用含Mg2+调节剂,整个发酵过程菌体代谢旺盛,发酵效果较佳。根据各碱性物质的调节能力以及对菌体生长代谢的影响,选择NaOH、Mg(OH)2和Na2CO3、Mg(OH)2分别作为混合碱组分调节pH,并对两组混合碱中各物质的质量比例进行优化。结果表明,以NaOH、Mg(OH)2混合,两者质量比为1:1时,发酵效果最好,丁二酸质量浓度高达到69.8g/L,质量收率74.5%。该种混合碱配比可有效替代碱式MgCO3调节pH,既达到高产丁二酸的目的,又可降低生物制备丁二酸的成本。

外源添加代谢中间体对产琥珀酸放线杆菌厌氧发酵制备丁二酸的影响

考察了外源添加中间代谢产物对菌体生长及发酵产酸的影响,结果表明添加0.5g/L磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)时丁二酸产量最高。围绕产琥珀酸放线杆菌NJ113厌氧发酵产丁二酸的代谢网络进行代谢通量分析,发现添加PEP后己糖磷酸途径(HMP)与糖酵解途径(EMP)的通量比由39.4∶60.3提高至76.8∶22.6,解决了丁二酸合成过程中还原力不足的矛盾,导致PEP生成草酰乙酸的通量提高了23.8%,丁二酸代谢通量从99.8mmol/(gDCW·h)增至124.4mmol/(gDCW·h),而副产物乙酸及甲酸的代谢通量分别降低了22.9%、15.4%;关键酶活分析结果表明,添加0.5g/LPEP后PEP羧化激酶比酶活达到1910U/mg,与对照相比提高了74.7%,而丙酮酸激酶的比酶活降低了67.5%。最终丁二酸浓度为29.1g/L,收率达到76.2%,比未添加PEP时提高了11.0%。

发酵产丁二酸过程中废弃细胞的循环利用

对厌氧发酵产丁二酸后的废弃细胞进行破壁处理,考察了以细胞水解液作为有机氮源重新用于丁二酸发酵的可行性。比较了超声破碎、盐溶、酶解3种方法破碎细胞获得的水解液作为氮源发酵产丁二酸的效果,结果表明酶解制得的细胞水解液效果最佳。以总氮含量为1.11g/L的酶解液(相当于10g/L酵母膏)作为氮源发酵,丁二酸产量可达42.0g/L,继续增大酶解液用量对耗糖、产酸能力没有显著提高。将细胞酶解液与5g/L酵母膏联用发酵36h后,丁二酸产量达75.5g/L,且丁二酸生产强度为2.10g/(L·h),比使用10g/L酵母膏时提高了66.7%。因此,厌氧发酵产丁二酸结束后的废弃细胞酶解液可以替代原培养基中50%的酵母膏用于发酵。