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内含埃博拉病毒GP基因序列假病毒粒子的构建及应用
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作者 龙云凤 陈金霞 +5 位作者 祝贺 陆冠亚 赵晓燕 叶银波 白吉山 姜焱 《临床医学进展》 2024年第2期4706-4713,共8页
目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) GP基因序列的假病毒粒子,针对EBOV GP基因建立实时荧光定量PCR检测方法。方法:人工合成GP基因序列,克隆至慢病毒包装载体pGWLV-pseudovirus中,转化DH5α感受态细胞,筛选得到阳性克隆pGWLV-GP质粒。将重... 目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) GP基因序列的假病毒粒子,针对EBOV GP基因建立实时荧光定量PCR检测方法。方法:人工合成GP基因序列,克隆至慢病毒包装载体pGWLV-pseudovirus中,转化DH5α感受态细胞,筛选得到阳性克隆pGWLV-GP质粒。将重组质粒转染293T细胞,培养48 h后进行除菌,纯化后获得高纯度假病毒,通过RT-PCR鉴定该假病毒粒子含有EBOV GP基因。通过荧光定量qPCR对假病毒颗粒进行计数后,利用本研究所获得的假病毒颗粒制备用于EBOV核酸检测的标准品。结果:建立了基于EBOV GP基因的Taqman荧光定量PCR检测方法。结论:该方法所用标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为EBOV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。 展开更多
关键词 埃博拉假病毒 GP基因 荧光定量PCR
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内含埃博拉病毒NP基因序列假病毒粒子的构建及应用
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作者 赵晓燕 陈金霞 +5 位作者 陆冠亚 祝贺 龙云凤 叶银波 白吉山 姜焱 《生物医学》 CAS 2023年第2期211-218,共8页
目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) NP基因序列的假病毒粒子,建立EBOV Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法:对埃博拉病毒的NP基因序列进行分析,分析基因是否包含重复序列,复杂二级结构以及高GC含量等;根据序列分析结果,合成NP全基因序列... 目的:构建内含埃博拉病毒(EBOV) NP基因序列的假病毒粒子,建立EBOV Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法:对埃博拉病毒的NP基因序列进行分析,分析基因是否包含重复序列,复杂二级结构以及高GC含量等;根据序列分析结果,合成NP全基因序列,并将NP基因的序列克隆至慢病毒包装载体pGWLV-pseudovirus中,转化DH5α感受态细胞,筛选得到阳性克隆pGWLV-NP质粒。将重组质粒转染293T 细胞,培养48 h后进行除菌,纯化后获得高纯度假病毒,通过RT-PCR鉴定该假病毒粒子含有EBOV NP基因。通过荧光定量qPCR对假病毒颗粒进行计数后,利用本研究所获得的假病毒颗粒制备用于EBOV核酸检测的标准品。结果:建立了基于EBOV NP基因的Taqman荧光定量PCR检测方法。本研究建立的基于包含NP基因的EBOV假病毒核酸cDNA的Taqman荧光定量PCR检测方法的Ct值与核酸cDNA标准品1 × 109~1 × 101个/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数可达到0.99。结论:该方法所用标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为EBOV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。 展开更多
关键词 埃博拉假病毒 NP基因 荧光定量PCR
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布鲁氏菌VirB12蛋白纯化及其抗体ELISA方法的初步建立 被引量:5
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作者 张婷婷 刘梦志 +5 位作者 冯生 杨江花 叶银波 陈泽良 沈国顺 刘宝山 《沈阳农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第2期154-160,共7页
为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在... 为获得高纯度布鲁氏菌VirB12蛋白,对VirB12分泌表达蛋白先后进行亲和纯化和离子交换纯化。将其作为抗原包被ELISA板,优化反应条件后初步建立了布鲁氏菌抗体的ELISA检测方法。结果表明:蛋白纯化效果良好,重组蛋白纯度可达到98%以上。在建立的ELISA中,纯化重组蛋白的最佳包被浓度为1μg·mL-1,最适封闭剂为5%脱脂奶粉,血清最佳稀释浓度为1∶25,酶标二抗最佳工作浓度为1∶1500。对20份阳性血清及12份阴性血清的检测结果表明,其与SUANOVIR Brucella-Ab C-ELISA试剂盒的总体符合率达到90.6%,表明本试验建立的以VirB12重组蛋白为抗原的ELISA方法可以检测布氏杆菌感染抗体,有望研制成试剂盒用于养殖场布病的检测和净化。 展开更多
关键词 布鲁氏菌 VirB12蛋白 纯化 ELISA
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