烟草BY-2细胞和蚕豆叶肉细胞原生质体微丝骨架及latrunculin B处理对其分布的影响

用酶解法分别制备烟草BY-2悬浮培养细胞和蚕豆叶肉细胞的原生质体,应用激光共聚焦显微镜观察经TRITC-鬼笔环肽荧光染色的2种原生质体的微丝骨架空间分布,以及观察用10和20μmol·L-1微丝抑制剂latrunculin B分别处理2种原生质体后对其分布的影响.结果表明:激光共聚焦显微镜清楚地显示出2种细胞原生质体中微丝精细排列的均匀网络结构;共聚焦显微成像显示了随latrunculin B处理时间的延长微丝解聚和微丝骨架分布的动态过程.建立原生质体制备、微丝骨架荧光染色、latrunculin B处理及激光共聚焦显微观察的实验体系为进一步研究植物微丝骨架的功能奠定了基础.

蚕豆萎蔫病毒2号VP37蛋白在BY-2细胞内的定位

将绿色荧光蛋白(GFP)连接于蚕豆萎蔫病毒2号(Broad bean wilt virus2,BBWV-2)VP37蛋白的N-端,构建融合基因GFP-VP37,用农杆菌法在BY-2悬浮细胞内进行表达,激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的分布。结果显示:GFP-VP37主要定位于细胞核的周围呈网络状,并在细胞边缘形成点状结构;ER-tracker标记显示VP37在细胞内与内质网共定位;电镜免疫金标记显示VP37蛋白主要定位在细胞质中;用BFA处理转染细胞后,VP37在细胞质及细胞边缘的定位受到抑制。推测内质网参与VP37的细胞内转运和分布。

进境油菜籽中十字花科黑斑病菌的检测

利用MT选择性培养基从加拿大进境油菜籽样品中分离到2株细菌分离物2305-1和5309-1，对分离物进行致病性测定、LOPAT测试、Biolog测试、hrpZ和印基因序列分析，以及多位点序列分析。结果表明：2株分离物人工接种油菜、花椰菜和番茄幼苗都能引起典型黑斑症状；LOPAT测试和Biolog测试结果与丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae）的各项生理指标一致；hrpZ基因序列与十字花科黑斑病菌（P．syringaepv．maculicola）和番茄细菌性叶斑病菌（P．syringae pv．tomato）的序列相似性均为99．18％-100％；cfl基因序列分析表明分离物2305一l和5309—1基因组中存在冠毒素合成基因；选择gyrB、ropD、gltA、gap1、acnB和pgi6个看家基因进行多位点序列分析，系统发育树显示分离物2305．1和5309—1均与P．syringaepv．ma．culicola聚在一起。根据试验结果将分离物2305．1和5309．1鉴定为十字花科黑斑病菌P．syringaepv．maculicola。

进境玉米中玉米内州萎蔫病菌的PCR检测

为了快速准确检测进境玉米样品中的玉米内州萎蔫病菌Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(Cmn),根据GenBank中Cmn的16S-23S序列设计引物CM1/CM4和引物PSM1/CM3。引物PSM1/CM3仅能从供试的4株Cmn菌株中扩增获得208 bp的预期产物,而其他36株对照菌株均不能扩增出预期条带。灵敏度测试结果表明引物CM1/CM4和PSM1/CM3组合的巢式PCR方法的检测灵敏度高于常规PCR,检测灵敏度可达40 fg DNA或6.8 CFU目标细菌。常规PCR和巢式PCR方法对进境美国玉米样品的阳性检出率分别为8%和24%,试验结果表明所建立的PCR方法可用于玉米样品中Cmn的快速检测。

利用ITS和mtDNA序列鉴定进境小麦样品中的黑麦草腥黑穗菌

从上海口岸进境美国小麦样品中发现一种腥黑穗菌冬孢子,其形态特征与黑麦草腥黑穗菌(Tilletia walkeri)相似。为了对该冬孢子进行准确鉴定,利用PCR扩增其ITS区和线粒体DNA序列,PCR产物测序结果显示ITS区序列和线粒体DNA序列均与T.walkeri高度相似。根据冬孢子形态特征、ITS区和线粒体DNA序列分析结果,将该冬孢子鉴定为黑麦草腥黑穗菌(T.walkeri)。

4种大豆种传病毒多重RT-PCR检测

进境大豆携带的病毒主要有菜豆荚斑驳病毒(BPMV)、烟草环斑病毒(TRSV)、烟草条纹病毒(TSV)和南方菜豆花叶病毒(SBMV)等,均为大豆种传病毒,可随大豆种子实现远距离传播。本研究对这4种大豆病毒的外壳蛋白基因部分序列设计引物,并通过优化引物、模板浓度和扩增参数,在一个体系中成功对4种病毒进行了多重RT-PCR扩增,得到307bp、206bp7、17bp5、18bp共4条特异性条带,建立了能同时检测BPMV、TRSV、TSV和SBMV的多重RT-PCR检测体系。该方法快速、灵敏、简便,同时特异性强,在出入境检疫中具有广泛的应用前景。