T-exo负载DC诱导抗肝癌细胞免疫效应研究

目的：观察肝癌细胞来源的外泌体（T-exo）负载DC体外诱导细胞毒T细胞（CTL）对肝癌细胞的杀伤作用。方法：采用超滤离心技术联合蔗糖密度梯度超速离心的方法从肝癌Huh-7细胞培养上清液中分离外泌体（T-exo）,透射电镜鉴定形态,Western blot检测外泌体相关蛋白CD9、CD63、HSP70及肿瘤抗原分子AFP的表达;分离健康供者外周血单个核细胞（PBMC）培养DC,流式细胞术鉴定负载T-exo的DC细胞表型;用2-（4-碘苯）-3-（4硝基苯）-5-（2,4-磺苯基四氮唑）-2H-四唑单钠盐-1（WST-1）法检测负载T-exo的DC刺激T淋巴细胞增殖情况;流式细胞术Annexin-V/PI双染法检测负载T-exo的DC诱导CTL分别对AFP阳性Huh-7细胞及AFP阴性的SMMC7721细胞的杀伤作用。结果：透射电镜下可见T-exo为圆形或椭圆形双层膜囊泡状小体,大小不等,平均直径50～100 nm,表达外泌体膜相关分子及肿瘤抗原分子。负载T-exo的DC可促进初始T细胞增殖,T-exo致敏DC对AFP阳性的Huh-7肝癌细胞系杀伤活性明显高于AFP阴性的SMMC7721肝癌细胞组（P〈0.05）及未负载T-exo的对照组DC（P〈0.05）。结论：负载T-exo的DC能促进T细胞增殖,提高CTL细胞的细胞毒活性诱导特异性的抗肝癌效应。经T-exo抗原致敏DC诱导的CTL对肝癌细胞有明显的细胞毒作用,明显高于DC对照组（P〈0.05）。

探讨地西他滨短时刺激对RAK细胞免疫表型及抗癌活性的影响

目的:探讨地西他滨(DAC)对重组人纤维连接蛋白活化杀伤细胞(RAK)增殖、免疫表型及抗肝癌效应的影响。方法:采用RetroNectin、CD3单抗及rhIL-2诱导外周血单个核细胞以培养RAK细胞,培养第1天加入不同浓度的DAC(0、50、500、1 000、2 000、3 000 nmol/L)刺激24 h后,全量换液。培养第4、7、10、12天,采用血球计数仪进行细胞计数,CFSE检测细胞增殖水平;流式细胞术检测不同培养时间各浓度DAC刺激的RAK细胞的免疫表型;Annexin-Ⅴ/PI检测细胞凋亡水平;以CD107a、IFN-γ、穿孔素、颗粒酶-B表达水平评估各组RAK细胞的抗肝癌效应。结果:随着培养时间延长,DAC浓度越高,细胞增殖抑制越明显(P<0.05)。与对照组相比,DAC短时刺激的RAK细胞在培养10 d后,高浓度DAC组(≥1 000 nmol/L)RAK细胞CD4比例显著增加,CD8比例及CD4+和CD8+的中央记忆细胞(TCM)比例呈下降趋势(P<0.05)。培养第12天NKT水平显著升高(P<0.05),随着DAC浓度增高细胞凋亡水平显著升高(P<0.05)。与其他DAC浓度组相比,1 000 nmol/L DAC刺激组CD107a、IFN-γ、穿孔素表达显著升高(P<0.05)。结论:RAK细胞经1 000 nmol/L DAC短时刺激后,可提高CD4、CD4+TCM及NKT比例,增强对肝癌细胞的细胞毒效应。