猪胸膜肺炎放线杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用

为建立检测猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)的可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,对比猪APP主要流行毒株的ApxⅣA基因序列,选择高度保守区域设计LAMP引物,以钙黄绿素(Calcein)为指示剂,对反应体系和反应条件优化后建立了一种快速检测猪APP的可视化LAMP方法。采用建立的方法在63℃水浴锅中扩增40 min后,85℃作用10 min即可完成检测。用该方法检测大肠杆菌、绿脓杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门菌、猪链球菌、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌等,均不发生交叉反应。以10倍稀释的APP基因组DNA为模板,评价方法的敏感性,结果最低检出量为1.67×10^(-5)ng/μL,比普通PCR方法的最低检出量1.67×10^(-2)ng/μL高1000倍;在反应体系中加入钙黄绿素,反应结束后阳性反应管颜色从橘黄色变为黄绿色且在紫外光下有绿色荧光。采用建立的方法检测312份临床样品,共检出阳性样品46份,而采用普通PCR方法仅检出阳性样品10份。该方法的建立为快速诊断猪传染性胸膜肺炎提供了技术支持。