山东省肠道病毒71型分离株SDLY11全基因组序列分析

目的了解2009年山东省临沂市分离的肠道病毒71型(EV71)分离株SDLY11的基因组序列特征,探讨病毒的神经毒力候选位点。方法自手足口病患者的粪便标本中分离EV71,采用一步法RT-PCR对病毒株基因组进行全序列扩增,运用DNAstar和MEGA 4软件进行序列分析。结果 SDLY 11基因组全长为7 405nt,其中5′非编码区(UTR)742nt,3′UTR 84nt,中间为6 579nt的开放阅读框架(ORF),编码2 193个氨基酸的多聚蛋白。VP1区及全基因组序列系统进化分析表明SDLY 11位于EV71病毒C4亚型的分支,同源性分析显示SDLY 11与安徽阜阳株同源性最高。序列比对结果发现,CNS累及HFMD患者病毒株在5′UTR区出现了两处核苷酸位点的突变(T40C、C575T),在VP2区第144位出现了氨基酸的突变(T144S)。结论 SDLY 11分离株属EV71病毒C4亚型。5′UTR区的两处突变(T40C、C575T)及VP2区的一处突变(T144S)可能与病毒的致神经毒力作用有关。

肠道病毒71型分离株基因特征分析

目的了解2009—2010年山东省临沂市肠道病毒71型(EV71)分离株的基因特征,初步探讨VPl区核苷酸或氨基酸变异与不同临床类型的关系。方法从手足口病(HFMD)病例、重症病例和死亡病例的粪便标本中分离获得23株EV71病毒株,RT-PCR扩增VP1区,并进行序列测定和分析。结果 23株分离株与A、B基因型同源性较低;与C4亚型的C4a群代表株的核苷酸和氨基酸同源性分别达到92.8%～93.5%和98.3%～99.3%,明显高于其他亚型代表株的同源性;各分离株间的氨基酸序列比对显示无特征性改变。结论 2009—2010年临沂地区流行的EV71是C4亚型的C4a群,HFMD病例、重症病例和死亡病例分离株VP1区核苷酸序列和氨基酸序列无特征性差异。

肠道病毒71型的分子流行病学研究进展

肠道病毒71型（Enterovirus71，EV71）自1974年首次报道以来，全世界很多国家和地区，如保加利亚、日本、韩国、新加坡、法国、澳大利亚、马来西亚均报告了EV71的流行。近年来，有研究表明EV71在亚太地区的流行呈上升趋势，已引起人们的广泛关注。在我国，2007年的山东及2008年的安徽、广东的EV71大规模流行，上万名婴幼儿感染，几十名婴幼儿死亡。现在，EV71已取代脊髓灰质炎病毒成为最主要的婴幼儿中枢神经病毒病原。本文主要就EV71分子流行病学特征方面作一综述，以探索基因变化对EV71流行、致病的影响。

肠道病毒71型山东临沂分离株全基因组序列分析

目的自1例死亡患儿的标本中分离EV71，并分析其全基因组序列特点，研究其基因序列的改变是否与其神经毒力有关。方法咽拭子标本采自山东临沂市人民医院1例死亡患儿，在人横纹肌瘤细胞（RD）上分离EV71，分段扩增获得EV71的全序列，用BLAST、Bioedit和MEGA4进行序列分析。结果获得1株EV71分离株SDLY107，基因组全长7405bp，全基因组核苷酸序列与2008年的阜阳株Fuyang．Anhui．P．R．C／17．08／2同源性最高，为98．6％，与原型株BrCr／70的同源性为80．O％，与神经毒型株MS／87的同源性为86．5％。系统进化分析表明，SDLY107与中国大陆的北京株、河南株、广西株、深圳株、兰州株、阜阳株、重庆株、浙江株的亲缘关系较近，按照传统的VP1基因分型方法，可归为C4亚型，是近年来我国大陆流行的主要基因亚型。氨基酸序列分析发现，SDLY107与其他毒株相比，有2个特有的突变（E947D，K1873R）。结论SDLY107分离株属于C4亚型，氨基酸突变E947D和K1873R可能与EV71的致病性有关。

肠道病毒71型山东临沂分离株3D区遗传进化分析

目的构建肠道病毒71型(EV71)山东临沂分离株3D区的系统进化树,进行遗传进化分析,探讨3D区与神经毒力的关系。方法于2009—2010年在山东省临沂市人民医院采集手足口病(HFMD)患儿的粪便标本和咽拭子标本107份,进行EV71的分离;用Bioedit和MEGA 4对EV71山东临沂分离株SDLY1、SDLY11、SDLY48、SDLY96、SDLY107的3D区进行序列分析,参比序列选自GenBank。结果 3D区的系统发生树分析结果显示,5株临沂分离株在发生树上比较集中,SDLY11、96、107的3D区同源性最高,与CoxA16原型株G-10的系统发生关系较近,与EV71原型株BrCr/70的系统发生关系较远;3D区碱基构成比和氨基酸构成比分析显示,含量最高的碱基为A(29%),含量最高的氨基酸为亮氨酸(>10%);基因序列比对和氨基酸序列比对分析结果显示,碱基突变较多,但大多为静默突变,临沂分离株与CoxA16 G-10之间的氨基酸突变中有很大一部分是赖氨酸与精氨酸之间的突变,在SDLY107的3D区发现了3个特有的氨基酸突变:N37S、K142R、G261E。结论 EV71山东临沂分离株3D区的进化可能与CoxA16 G-10有关,突变N37S、K142R、G261E可能与EV71的神经毒力有关。

肠道病毒71型VP2蛋白对细胞损伤作用

目的研究VP2蛋白在肠道病毒71型(EV71)致病机制中的作用。方法采集山东省临沂市人民医院轻症和重症手足口病(HFMD)患儿的粪便标本(SDLY 11和SDLY 107),应用MEGA 4.0软件对SDLY 11、SDLY107 VP2区氨基酸序列进行比对分析;参考SDLY 11、SDLY 107全序列测序结果设计VP2区扩增引物,构建表达载体VP2p Bluescript SK(+),通过体外转染Vero细胞表达VP2蛋白;乳酸脱氢酶实验检测不同临床症状病毒株的VP2蛋白对细胞损伤的影响。结果序列比对分析结果显示,SDLY 11、SDLY 107 2个病毒株的VP2蛋白在第199位氨基酸处存在差异(V199I);SDLY 11、SDLY 107的VP2蛋白可在Vero细胞中表达;乳酸脱氢酶实验结果显示,2组蛋白对细胞损伤情况差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EV71的VP2蛋白可能对细胞损伤的影响不大,其在致病机制中的意义尚需进一步研究。

不同免疫方案制备肠道病毒71型抗血清的免疫效果比较

目的比较不同免疫方案制备肠道病毒71型(EV71)抗血清的免疫效果,选择最佳免疫方案。方法制备EV71,并对病毒进行滴定和灭活。将BALB/c鼠随机分为5组,每组9只。1、2组以灭活病毒免疫,3、4组以活病毒免疫,1、3组的免疫间隔时间为2周,2、4组为3周,第5组为对照组,用磷酸盐缓冲液(PBS)免疫,免疫间隔2周。免疫4次后用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测各组小鼠血清抗体滴度。结果 4个实验组均产生阳性抗体(A/A0≥2.1),对照组抗体阴性(A/A0<2.1),1～5组吸光度值依次为1.081 7±0.289 7、1.029 6±0.3719、1.074 8±0.374 9、1.492 9±0.215 9、0.168 7±0.021 8。对其进行单因素方差分析,F=23.449,P<0.05,差异有统计学意义,LSD-t检验结果,第4组与1、2、3组差异均有统计学意义(P<0.05),而1、2、3组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论各组抗体滴度不完全相同,其中第4组即活病毒间隔3周免疫组抗体滴度最高,所以活病毒间隔3周免疫方案可作为制得高滴度EV71抗血清的理想选择。

尿液分析测试纸在器械清洗质量评价中的应用

目的 观察尿液分析测试纸在器械清洗效果中的灵敏度.方法 试验中对器械执行标准手工处理流程,首先使用三磷酸腺苷(ATP)测试法和尿液分析测试纸测试法采集实验中期数据,分析其是否和ATP测试法存在相关关系,并指示清洗质量结果;其次使用目测法、ATP生物荧光测试法和尿液分析测试纸测定法采集实验末期数据,确定尿液分析测试纸测定法指示器械清洗合格的评价临界值.结果 ATP测试法和尿液分析测试纸测定法为正相关,相关系数0.30≤r≤0.75;且对完成标准清洗流程的300件妇科吸引器进行目测法、ATP生物荧光测试法和尿液分析测试纸测定法检测(全“-”组),清洗合格率分别为95.67％ (287/300)、86.33％(259/300)和83.37％ (251/300),因此,尿液分析测试纸测定法检测全“-”即为清洗质量合格评价临界值,尿液分析测试纸测定法的合格率比目测法低14.46％,二者比较,x2=63.35,P＜ 0.05,差异具有统计学意义.结论 尿液分析测试纸测定法检测效果灵敏,方法简单,成本较低,是可广泛应用于医疗器械清洗质量评价的半定量日常检测方法.

肠道病毒71型基因组5'非编码区序列分析

目的了解2009年山东省临沂市分离的肠道病毒71型(EV71)基因组5'非编码区(5'UTR)序列特征,探讨基因组中引起神经毒性作用的候选位点。方法从手足口病患者的粪便标本中分离EV71,运用一步法逆转录聚合酶链反应扩增8个病毒株的5'UTR区,运用DNAstar和MEGA 4软件进行序列分析。结果 8个病毒株5'UTR区核苷酸为741～745 nt,核苷酸序列同源性介于97.0%～99.9%,8个病毒株的5'UTR区与C4亚型的同源性最高。序列比对发现,在5'UTR区第265 nt及703 nt处出现了核苷酸的突变(G265A,G703T)。遗传进化分析显示,8个病毒株序列与C4亚型的亲缘关系最为密切。结论此8个病毒株为C4亚型,核苷酸突变(G265A,G703T)可能与EV71的致神经毒性作用有关。