A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗rCPA-HSP65的生物活性研究

产气荚膜梭菌是一种革兰氏阳性厌氧菌，广泛分布于土壤、食物、污水、粪便及许多健康人和动物的肠道中，引起人或动物的各种组织毒性感染，包括气性坏疽、厌氧性蜂窝织炎和单纯的创伤感染，另外还可引起人或动物的肠炎和肠毒血症。根据该菌产生的各种毒素可将其分为A～E五种类型，其中A型产气荚膜梭菌产生的α毒素（CPA）是引起各类疾病最关键也是最重要的致病因子，它是一种依赖于锌离子的多功能性金属酶，是第一个被鉴定为酶类的细菌毒素。

抗B型肉毒毒素治疗性胞内抗体的制备及活性研究

以克隆表达的B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)为抗原,从噬菌体抗体库Tomlinson I+J筛选出得到活性高和特异性高的全人源单链抗体(Sc Fv),结合能够携带外源蛋白有效通过生物膜的小片段跨膜肽(TAT)制备跨膜单链抗体(TAT-Sc Fv)。经PCR后酶切,克隆到原核表达载体(p ET-28a-TAT)中,构建含有跨膜肽(TAT)的抗B型肉毒毒素胞内抗体融合蛋白,并在大肠杆菌中诱导表达,进行纯化工艺,对产物进行浓度纯度、亲和常数测定及生物活性研究。成功构建TAT-Sc Fv表达载体,融合蛋白相对分子量为32.7 k Da,主要以可溶形式表达,纯度也达到95%以上,胞内抗体中和B型肉毒毒素致病轻链得到TAT-Sc Fv的亲和常数为(1.133±0.273)×106L/mol,小鼠神经细胞乙酰胆碱定量测定实验证明胞内抗体具有较好的抗毒素活性。此结果为B型肉毒毒素治疗性胞内抗体的研制和肉毒中毒治疗奠定了基础。

舌癌CAL-27细胞GnRHR的检测及曲普瑞林对细胞增殖抑制作用研究

目的研究I型促性腺激素释放激素(GnRH-I)类似物(GnRHa)曲普瑞林(Triptorelin)对人舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株的体外增殖抑制作用。方法利用RT-PCR方法检测CAL-27细胞株GnRHR mRNA。Western Blot法检测CAL-27细胞表面GnRHR蛋白表达。通过CCK-8法检测曲普瑞林对CAL-27细胞的生长抑制作用。结果经RT-PCR法检测显示CAL-27细胞存在GnRHR mRNA。Western Blot结果显示,CAL-27细胞蛋白在60kDa处存在GnRHR特异性反应条带。CCK-8检测结果显示,曲普瑞林对CAL-27细胞抑制率呈现浓度依赖性,且差异显著(P<0.01)。结论舌鳞状细胞癌CAL-27细胞株中GnRHR基因及蛋白呈阳性,曲普瑞林对CAL-27细胞增殖具有抑制作用。

抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源双价单链抗体的构建、表达及其活性的初步研究

目的:为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠毒血症及气性坏疽等相关疾病,构建并高效表达中和α毒素(CPA)的特异性双价单链抗体,并对其生物学活性进行初步研究。方法:以全人源噬菌体抗体库中筛选得到的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体sc Fv基因为模板,PCR的方法扩增两条单链抗体片段并通过引物设计引入中间连接肽G4S或(G4S)3,亚克隆至原核表达载体p ET-28a(+),转化E.coli BL21,IPTG诱导表达、鉴定及表达产物的层析纯化;Western blot和间接ELISA方法检测与抗原的免疫结合活性;通过体外检测抗体抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及体内小鼠攻毒保护试验初步研究双价单链抗体的生物学活性。结果:双酶切鉴定及基因测序结果表明构建的双价单链抗体sc(Fv)2-5和sc(Fv)2-15均正确,诱导表达后经12%SDS-PAGE分析,两者均以包涵体形式表达且蛋白分子量符合理论值大小,Western blot和间接ELISA分析结果显示,构建的双价单链抗体与抗原CPA具有特异结合活性,且sc(Fv)2-15与抗原的结合活性明显高于sc(Fv)2-5和sc Fv,体外与体内生物活性试验结果进一步证明,sc(Fv)2-15中和毒素的能力较sc(Fv)2-5和sc Fv具有明显优势。结论:成功制备了抗A型产气荚膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体,为进一步研究该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。

A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65的原核表达及其纯化

目的原核表达A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,并进行纯化。方法以CPA全基因为模板,PCR扩增rCPA基因,插入表达质粒p ET-28a(+)-HSP65,构建重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物进行12%SDS-PAGE分析;优化表达工艺进行高密度发酵,发酵产物经DEAE阴离子柱上复性后,再经金属螯合层析纯化。结果重组表达质粒p ET-28a-rCPA-HSP65经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的重组蛋白相对分子质量约90 000,主要以可溶性形式为主,表达量占菌体总蛋白的30.17%。利用TB培养基,IPTG 34℃诱导5 h的表达产物经纯化后,纯度约达95%,蛋白收率为4.5 mg/g湿菌。结论已成功表达并纯化了A型产气荚膜梭菌α毒素疫苗抗原rCPA-HSP65,为后期疫苗生物学活性的研究奠定了基础。

用于肉毒毒素活性测定的特异性绿色荧光融合蛋白的制备

目的制备含有7种血清型肉毒毒素切割位点(SNAP25-VAMP)的特异性绿色荧光融合蛋白,在E.coli中诱导表达,纯化后用于肉毒毒素活性测定。方法根据SNARE蛋白复合物中SNAPE25和VAMP基因序列及各血清型肉毒毒素(Bo NTs)的切割位点,设计合成含有SNAREs中突触小体(SNAP25)和突触小泡膜蛋白(VAMP)的Bam HⅠ-HIS6-SNAP62-Eco RⅠ-VAMP57C-TAA-HindⅢ(以下简称为SV)基因,连接至p ET-28a-GFP载体上,构建重组质粒p ET-28a-GFP-SV,转化感受态E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达后,经DEAE阴离子交换层析、Cu2+金属螯合层析、Q阴离子交换层析3步纯化,BCA法测定纯化产物的蛋白浓度,ELISA法检测B型肉毒毒素轻链蛋白(Bo NT/BL)活性。结果构建的质粒p ET-28a-GFP-SV经双酶切及测序鉴定证明构建正确,表达的GFP-SV融合蛋白相对分子量约40 000,主要以可溶形式存在,蛋白浓度为18.4μg/μl,纯度可达70%以上。利用该融合蛋白的荧光强弱变化可测定Bo NT/BL活性大小,同时也可测定其抗体中和活性大小。结论制备的含有SV的特异性绿色荧光融合蛋白在E.coli中获得了高效表达,为后续各型肉毒毒素活性检测及抗体中和毒素活性检测奠定了基础。