绵羊肝细粒棘球蚴包囊形成不同时期的病理学变化观察

目的 观察绵羊细粒棘球蚴包囊形成不同时期的肝细胞损伤、局部炎症反应,以及包囊纤维蛋白组成的病理学特征。方法 收集新疆乌鲁木齐市某屠宰场阿勒泰羊中有明显细粒棘球蚴包囊的肝脏,根据包囊的形态特征分为包囊发育期组、包囊形成期组和包囊成熟期组,取各组包囊与健康肝组织交界处的病变组织制备切片,以健康羊肝组织为对照组。苏木素-伊红(HE)染色观察包囊周围肝细胞形态特征及周围组织形态学变化,Masson染色观察包囊形成不同时期囊壁的纤维化过程,透射电子显微镜观察肝细胞超微结构变化,免疫组织化学染色观察不同时期包囊及其周围组织的炎症细胞CD3^(+)T淋巴细胞(CD3^(+))、CD25^(+)调节性T细胞(CD25^(+))、CD56^(+)自然杀伤细胞(CD56^(+))、CD14^(+)单核巨噬细胞(CD14^(+))、嗜碱粒细胞CD63 (CD63),以及纤维化蛋白Ⅰ型胶原蛋白1 (COL1)、COL3、α-平滑肌动蛋白(α-SMA)、钙结合蛋白A4 (S100A4)、基质金属蛋白酶2 (MMP2)和细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、血管内皮生长因子受体-3 (VEGFR-3)的表达变化。组间比较采用单因素ANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验。结果 HE染色结果可见,包囊发育期,囊壁有明显的炎症反应带及炎症细胞团的形成,炎症细胞向囊外周肝实质扩散;包囊形成期,囊壁变薄,炎症细胞数量明显减少,炎症反应带变薄;包囊成熟期,囊壁纤维组织增生形成包囊的外壁角质层,炎症细胞数量减少。Masson染色结果可见,包囊发育期的囊壁外周有大量纤维组织产生,并向周围肝组织内延伸;包囊形成期包囊生长发育,炎症反应减弱,囊壁纤维组织发育成熟;包囊成熟期形成致密的纤维性囊壁。透射电子显微镜观察可见,随着包囊发育形成,肝细胞线粒体逐渐肿大、数量增多,肝细胞中的脂滴数量增多、体积增大。免疫组织化学染色结果显示,随着包囊的增大,囊壁炎症反应带变薄,炎症细胞阳性表达范围减小,表达量减少;包囊形成期、包囊发育期、包囊成熟期的炎症细胞平均光密度值,CD3^(+)分别为0.171±0.009、0.132±0.009、0.120±0.006 (F=1.640,P> 0.05),CD25^(+)分别为0.302±0.012、 0.174±0.009、 0.080±0.005 (F=49.051, P <0.01), CD56^(+)分别为0.219±0.008、 0.209±0.009、0.118±0.004 (F=126.411,P <0.01),CD14^(+)分别为0.140±0.027、0.096±0.012、0.090±0.017 (F=3.954,P>0.05),CD63分别为0.318±0.007、0.096±0.013、0.086±0.011 (F=307.442,P <0.01);纤维化蛋白阳性表达范围增大,表达量增多,平均光密度值COL1分别为0.139±0.029、0.157±0.022、0.186±0.014 (F=2.136,P>0.05),COL3分别为0.109±0.014、0.144±0.008、0.206±0.008 (F=42.116,P <0.01),α-SMA分别为0.255±0.008、0.283±0.009、0.301±0.022 (F=5.106,P <0.05),S100A4分别为0.210±0.012、0.248±0.004、0.258±0.007 (F=18.137 3,P <0.01),MMP2分别为0.155±0.002、0.172±0.011、0.185±0.008 (F=7.853,P <0.05);TNF-α在包囊周围组织表达,阳性表达范围增大,表达量增多,平均光密度分别为0.115±0.016、0.263±0.003、0.267±0.006 (F=145.627,P <0.01);VEGFR-3在包囊壁表达,包囊形成期表达最多,3个包囊期分别为0.248±0.009、0.357±0.045、0.268±0.004 (F=9.423,P <0.05);3个包囊期各指标的平均光密度值均高于健康肝脏(均P <0.01)。结论 随着包囊发育,包囊及周围肝组织具有不同程度的肝细胞损伤、囊壁结构变化和纤维化反应,肝脏线粒体代谢加强,影响脂肪代谢。

抗寄生虫中药活性成分体外抗细粒棘球蚴作用

目的评价抗寄生虫中药水提物和有机溶剂粗提物体外对细粒棘球蚴的作用效果。方法从感染绵羊肝脏细粒棘球蚴包囊中分离原头节,体外培养24 h后,取活性大于95%的原头节(100μl,约100个)加入96孔板,分别加入终浓度为0.8 mg/ml(低浓度组)、1.6 mg/ml(中浓度组)、3.2 mg/ml(高浓度组)的鸦胆子、苦楝皮、辣蓼、石榴皮、使君子、槟榔、贯众、鱼藤、马蔺子、五倍子和仙鹤草等11种抗寄生虫中药的水提物,体外作用72 h后,伊红染色法检测原头节活性,倒置显微镜观察下观察原头节的形态,计算死亡率;同时设相同浓度的阿苯达唑组和空白对照组。从具有体外抗原头节作用的中药中提取黄酮、多糖、皂苷和生物碱等粗提物,分别以终浓度1.00 mg/ml体外作用于原头节72 h后,观察原头节形态,计算死亡率;同时设空白对照组。对体外抗原头节效果明显的粗提物进行液相色谱与串联质谱联用分析。组间比较采用单因素ANOVA分析,两两比较采用LSD-t检验。结果中药水提物作用72 h后,鸦胆子、苦楝皮、辣蓼水提物高浓度组原头节边缘模糊,结构松散,基质溶解;其余8种中药水提物高浓度组原头节形态正常,各部分结构清晰;阿苯达唑组原头节生发层有轻微损伤;空白对照组原头节形态正常。体外培养72 h后,鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物高浓度组原头节的死亡率分别为(99.63±0.57)%、(90.89±1.10)%和(51.93±0.60)%,中浓度组分别为(85.97±1.50)%、(81.14±1.19)%、(42.46±0.56)%,低浓度组分别为(78.34±1.35)%、(77.27±0.92)%、(36.66±0.60)%,与空白对照组[(0.62±0.51)%]相比差异均有统计学意义(F=180678.22、41488.99、44346.38,19543.86、27887.32、34590.79,20059.467、41953.68、17993.77,均P<0.01),与阿苯达唑组[(30.03±2.02)%]比较差异均有统计学意义(F=6585.72、4210.84、646.46,2956.80、2849.68、210.83,2365.92、2712.28、58.12,均P<0.01);其余8种中药水提物高、中、低浓度组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷、辣蓼皂苷和辣蓼生物碱组原头节皱缩、结构松散、基质溶解,原头节死亡率分别为(98.33±2.89)%、(96.67±5.77)%、100%、(99.33±1.15)%和(56.67±2.11)%,与空白对照组[(10.33±2.51)%]比较差异均有统计学意义(F=1584.00、563.71、3808.47、3099.52、14.65,均P<0.01);其余中药粗提物组原头节的死亡率与对照组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。液相色谱与串联质谱联用分析结果显示,正、负离子模式下分别鉴定出741、398种代谢产物,其中正离子模式下从鸦胆子黄酮粗提物中鉴定出差异显著的黄酮类化合物4种,分别为漆黄素、5-甲基-7-甲氧基异黄酮、儿茶素和甜橙黄酮;负离子模式下鉴定出8种,分别为原花青素B2、槲皮素-3β-D-葡萄糖苷、枸桔苷、橙皮素、槲皮素、木犀草素、芹菜素和黄豆黄素。结论鸦胆子、苦楝皮和辣蓼水提物,鸦胆子黄酮、苦楝皮黄酮、鸦胆子皂苷和辣蓼皂苷有明显体外抗细粒棘球蚴的作用,且效果优于阿苯达唑。