“微视频、翻转课堂、传统教学”在《兽医临床诊断学》实验教学新模式的探索与实践

《兽医临床诊断学》实验课技能操作要点多和操作技术抽象,多年来一直采用传统教学方法。该文以翻转课堂展示为模式,将课本内容系统地分成不同模块制作微视频,探索信息化和自主学习相融合的“四步法”新模式。结果发现,该模式极大地提高了学生主动学习专业理论知识的意识以及主动掌握和提高操作技能的意识,为提高本科实验教学质量与改革提供了新的思路和参考。

转录组测序及其在反刍动物中的应用研究进展

近年来,随着下一代测序技术的快速发展和成本降低,转录组测序(RNA-seq)已经成为一种全面而准确的基因表达模式分析工具。反刍动物,尤其是牛羊等具备较高的经济价值,因此,研究反刍动物的转录组测序具有重要意义。本文介绍了RNA-seq技术及其在反刍动物应用中的最新研究进展,为反刍动物基因组学研究提供参考依据。

GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达及亚细胞定位

旨在探究GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟进程中的表达规律及亚细胞定位.通过卵母细胞体外培养技术、qPCR技术及免疫荧光技术测定GPR50在小鼠不同时期卵母细胞的转录水平及亚细胞定位.结果表明,所建立的qPCR方法敏感性高、特异性强、重复性好且检测效率高,可用于测定GPR50在小鼠卵母细胞中转录水平的表达;GPR50在不同阶段小鼠卵母细胞中均有表达,生发泡破裂(GVBD)后,GPR50的表达量显著高于GV期(P<0.05);随着卵母细胞的发育,其表达量不断增高,到MII期达到顶峰,极显著高于GV、GVBD及MI期(P<0.01).随着卵母细胞的发育,GPR50大量表达于细胞质和细胞膜,但在成熟卵母细胞中,GPR50主要集中分布于细胞膜.以上结果说明,GPR50在小鼠卵母细胞体外成熟中发挥重要的作用,为解析GPR50在哺乳动物卵母细胞体外成熟进程的分子机制奠定了基础.

牛多能干细胞研究进展

多能干细胞(PSCs)是一类能够无限自我更新的细胞,能够分化成各种类型的组织,促进基因编辑和再生领域发展。牛作为最常见的家养有蹄类动物之一,具有很高的经济价值和遗传潜力,因此衍生稳定的牛多能干细胞对理解牛胚胎发育分子机制有着积极作用。目前,人们已在牛胚胎干细胞(bESCs)和诱导多能干细胞(biPSCs)方面做了诸多研究,但建立与小鼠和人类相当的bESC仍具有挑战性。文章重点综述了牛胚胎干细胞的各种衍生方式以及多能性维持的内部信号通路和外部微环境的相互作用,并介绍了诱导多能干细胞、扩展潜能干细胞的特点,以期为牛干细胞的相关领域提供参考。

牛诱导多能干细胞的建立及应用研究进展

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为可以无限增殖更新并具有分化为三胚层多种细胞类型的一类干细胞系。目前对人与小鼠的iPSCs研究已经取得了很多重要成果,但其他动物,如牛等经济型有蹄类家畜iPSCs的研究始终没有突破性的进展。如何将外源转录因子通过重编程载体高效安全地导入体细胞中并持续表达是生产牛诱导多能干细胞(bovine induced pluripotent stem cells,biPSCs)的主要瓶颈。本文就biPSCs建立中重编程系统的选择、诱导因子的选择、小分子化合物的添加等方面进行综述,以期为进一步完善biPSCs及牛胚胎干细胞系的建立提供参考。

仔猪亚硝酸盐急性中毒致死剂量的探究

为探讨仔猪亚硝酸盐急性中毒的致死剂量,采用经口灌服不同剂量的亚硝酸钠复制仔猪亚硝酸盐中毒模型,结果发现:试验组高低剂量组的仔猪均出现黏膜发绀、呼吸困难、强直性痉挛等症状,最后窒息而死;低剂量组可被亚甲蓝救治成功,高剂量组发病较快难以解救。本研究表明,0.25 g/kg的亚硝酸钠即可导致仔猪急性中毒和死亡。

维生素A对牦牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响

【目的】探究维生素A对牦牛卵母细胞体外成熟及后续胚胎发育能力的影响。【方法】以牦牛卵母细胞为研究对象,在其体外成熟培养液中分别添加0(对照组)、2、5、10和20μmol/L维生素A,体外培养24 h统计第一极体排出率;对成熟后各组卵母细胞进行孤雌激活,在孤雌激活胚胎培养的第2和8天分别统计卵裂率和囊胚率;用实时荧光定量PCR检测各组MⅡ期卵母细胞中维生素A调控卵母细胞成熟典型信号通路中的节点基因RARα、RARβ、RARγ、RXRα、RXRβ、RXRγ、STRA8及非典型信号通路中的节点基因MEK和ERK1的相对表达量,筛选最佳维生素A处理浓度。在体外成熟培养液中添加最佳浓度维生素A,成熟6和24 h分别收集MⅠ和MⅡ期卵母细胞,将部分MⅡ期卵母细胞进行孤雌激活,收集激活8 d的囊胚,用实时荧光定量PCR检测GV、MⅠ和MⅡ期卵母细胞及孤雌激活囊胚中RARα、RXRα、STRA8基因的相对表达量。【结果】与对照组相比,2、5和10μmol/L维生素A组第一极体排出率和卵裂率均显著提高(P<0.05),且2μmol/L维生素A组均达到最高;2μmol/L维生素A组囊胚率显著提高(P<0.05),20μmol/L维生素A组第一极体排出率、卵裂率和囊胚率均显著降低(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,2、5、10和20μmol/L维生素A组RARα、RXRα和STRA8基因的相对表达量均显著增加(P<0.05),其中2μmol/L维生素A组均达到最高,因此2μmol/L维生素A对牦牛卵母细胞体外成熟的效果最好。与GV期卵母细胞相比,STRA8、RXRα、RARα基因的相对表达量在MⅡ期卵母细胞均极显著增加(P<0.01),在MⅠ及囊胚期差异均不显著(P>0.05)。【结论】在体外成熟过程中,添加2μmol/L维生素A可以促进牦牛卵母细胞的成熟,能够显著提高孤雌激活胚胎的卵裂率,且维生素A主要通过典型信号通路调控牦牛卵母细胞的成熟。

鸡传染性支气管炎病毒地方流行株的分离鉴定及免疫试验

从山西疑似IB的病料中,分离到1株IBV分离株,该分离株在电镜下可见到直径为60～120nm,有囊膜及纤突呈冠状排列的病毒粒子;对NDV有明显的干扰作用;分离株的传代物都有明显的致鸡胚矮小化作用;动物回归感染死亡鸡肾脏病变明显,表现肾脏肿大、花斑肾现象,输尿管内充塞大量尿酸盐;无直接血凝性,经1%胰酶处理后可凝集鸡红细胞;分离株对乙醚和氯仿敏感;采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)对分离毒株进行扩增,结果均扩增出特异N基因核酸片断,以上结果表明该分离病毒为IBV。将该分离株制备灭活苗进行免疫试验,试验保护率为100%,结果显示了该分离株具有良好的免疫效力。

华东部分地区猪群中猪萨佩罗病毒分子流行病学调查

为了解华东地区猪群中猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)感染流行情况,通过RT-PCR方法对该地区15个规模化养猪场960份猪粪便样本进行了检测。结果表明,所检测的15个养殖场均存在PSV感染,总体平均阳性率为17.2%,其中10周龄～20周龄的猪PSV最易感。进一步系统进化分析表明,所检阳性毒株同源性较高,不同地区的毒株交错分布在一起,不存在明显的地区差异,但大体可分为3个亚群,而且已有的国外PSV株均包括在这3个亚群中,这提示PSV可能至少存在3种不同的抗原亚型。

鸡传染性支气管炎病毒地方流行株的分离与鉴定

从山西各地区疑似鸡传染性支气管炎（IB）的病料中，分离到5株鸡传染性支气管炎病毒（IBV）分离株，并对分离病毒进行了病毒形态观察、对鸡新城疫病毒（NDV）的干扰、鸡胚致病性试验、动物回归试验、血凝特性试验、病毒理化特性测定等生物特性鉴定及IBVN基因特异性片段的检测。电镜观察，可见直径为60～120nm，有囊膜及纤突呈冠状排列的病毒粒子；对NDV有明显的干扰作用；分离株的传代物均有明显的致鸡胚矮小化作用；动物回归感染死亡鸡肾脏病变明显，表现肾脏肿大、花斑肾现象，输尿管内充塞大量尿酸盐；无直接血凝性，经1％胰酶处理后可凝集鸡红细胞；分离株对乙醚和氯仿敏感；采用反转录-聚合酶链式反应（RT—PCR）对分离毒株进行扩增，结果均扩增出特异N基因核酸片段。

鸡传染性支气管炎病毒地方分离株S1、N和M基因的克隆与表达

为研究鸡传染性支气管炎病毒DNA疫苗,构建了表达IBVS1、M和N基因真核表达载体,并且BHK-21细胞和小鼠体内进行了表达检测,将IBVSX16株的S1、N和M基因克隆入真核表达载体pVAX1,构建IBV真核表达载体pVAX1-16S1、pVAX1-16N和pVAX1-16M。体外转染BHK-21细胞,用间接ELISA检测到目的蛋白表达,用构建的3个表达载体免疫小鼠,从小鼠血清中检测到了抗IBV抗体,初步证实用IBVS1、N和M基因作为核酸疫苗免疫动物,可以激活机体免疫应答。

一株鸡传染性支气管炎病毒地方分离株膜蛋白基因的遗传变异分析

对从山西省分离到的1株IBV(IBVSX16)的膜蛋白基因片段进行序列测定及分析,结果发现,IBVSX16株膜蛋白基因含有一个长681bp的ORF,编码226个氨基酸残基组成的多肽,与疫苗株H120和中国分离株LX4推导的氨基酸序列比对发现,存在基因突变现象,未发现缺失和插入现象,变异主要发生在2～l7位。系统进化关系显示19株IBV毒株分属于5个群。IBVSX16株位于第II群,中国IBV分离毒株主要集中在第III群和第Ⅳ群,具有较明显的地理区域性,可见IBV分离株在基因进化关系上形成了自己较为独立的进化群。

鸡大肠杆菌和沙门氏菌混合感染的分离鉴定及药敏试验研究

无菌采取某鸡场送检的病死鸡的心血、肝、肾,进行病原菌的分离、鉴定、生化试验和药敏试验。结果显示引起该鸡场鸡只发病的病原除大肠杆菌外,还伴有沙门氏菌。药敏试验结果显示,此次分离的大肠杆菌对庆大霉素、氟哌酸、氯霉素高度敏感,对复方磺胺、链霉素、环丙沙星中度敏感,对阿莫西林、利福平、卡那霉素不敏感。此次分离的沙门氏菌对氯霉素、阿莫西林、卡那霉素高度敏感,对庆大霉素、复方磺胺、氟哌酸、环丙沙星中度敏感,对利福平、链霉素不敏感。

鸡传染性支气管炎研究进展

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis,简称IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian Infectious Bronchitis Virus,IBV)引起鸡的一种急性高度接触性传染病,主要侵害鸡的呼吸、泌尿生殖和消化系统。IBV往往引起混合感染,并可继发细菌性疾病,从而加重了对鸡群的危害。目前,IBV的血清型至少有29种之多,并且新的血清型和变异株不断出现。在实际生产中,免疫失败的现象时有发生,传染性支气管炎成为禽病防治中难于控制的“顽症”。

GPR50生物学功能研究进展

G蛋白偶联受体50(G protein-coupled receptor, GPR50)是属于G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)超级家族的一类跨膜蛋白,与Mel1c受体同源,介导跨膜转运和信号传递,在神经系统发育、能量代谢调节及糖皮质激素受体信号等多种生理活动中发挥重要作用,同时也是阿尔茨海默病、肝癌等疾病的潜在生物学标志物,阐明GPR50的生理功能有助于为相关疾病治疗的进展、预后和发展提供可能方向.近年来,随着GPR50潜在作用不断被发现,其涉及的生理功能也不断被拓宽.详细介绍了GPR50的分子结构特征,总结了近年来GPR50的生物学功能研究进展,为GPR50的进一步研究提供参考.

大肠杆菌O157 Stx噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析

为研究大肠杆菌O157Stx噬菌体编码的裂解酶(内溶素)对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用,克隆表达了大肠杆菌O157Stx噬菌体裂解酶,并检测其裂解作用和裂菌谱。利用PCR方法扩增大肠杆菌O157Min27株中Stx2噬菌体裂解酶基因(R基因),构建表达质粒pET28a(+)-lysEC1,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)。重组质粒在BL21中获得了高表达,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的34%,经His-trapTM亲和层析柱纯化后,获得的重组LysEC1的纯度大于97%。体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶LysEC1对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用,这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向。

G蛋白偶联受体50在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与亚细胞定位研究

试验旨在研究G蛋白偶联受体50(G protein-coupled receptor 50,GPR50)在牦牛卵母细胞体外成熟过程中的表达与定位规律,为进一步解析卵母细胞成熟的分子机制及理解牦牛繁殖的特异性提供依据。通过牦牛卵母细胞体外成熟培养,利用免疫荧光染色监测不同时间点(0~24 h)纺锤丝形态和核相的变化,确定牦牛卵母细胞减数分裂4个时期,包括生发泡期(germinal vesicle,GV)、生发泡破裂期(germinal vesicle break down,GVBD)、第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)与第二次减数分裂中期(metaphaseⅡ,MⅡ)的时间点。在此基础上,通过实时荧光定量PCR检测GPR50基因在牦牛卵母细胞成熟过程中的动态表达量,免疫荧光染色检测GPR50蛋白在卵母细胞成熟过程中的的亚细胞动态定位情况。结果表明,牦牛卵母细胞体外成熟0 h时90%处于GV期,6 h时94%处于GVBD期,16 h时92%细胞处于MⅠ期,24 h时94%处于MⅡ期。实时荧光定量PCR结果表明,GPR50基因在牦牛卵母细胞GV期即有表达,并在GVBD、MⅠ、MⅡ期成熟过程中逐渐升高,在MⅡ期达到顶峰,且极显著高于GV与GVBD期(P<0.01)。GPR50蛋白在牦牛卵母细胞GV期时集中在膜上表达,并随着成熟进程的发展在细胞质和细胞膜均大量表达,在MⅡ期高亮度弥散表达。以上结果表明,GPR50基因参与牦牛卵母细胞减数分裂过程并发挥重要作用,为研究GPR50在牦牛卵母细胞成熟过程中的作用及机制提供了依据。

猪链球菌噬菌体SMP末端酶大亚基单位的活性研究

末端酶(terminase)是dsDNA病毒包装过程中的必要功能蛋白,其大亚基单位在包装过程中往往行使全酶的作用,一般具有ATP酶活性和限制性内切酶活性。噬菌体SMP是猪链球菌2型的烈性噬菌体,本研究以SMP基因组为模板,扩增SMP末端酶大亚基单位基因(TlsSMP),构建pEASY-E1-Tls重组质粒,在大肠杆菌中诱导表达,并对TlsSMP融合蛋白进行活性检测。结果显示,末端酶大亚基单位在大肠杆菌中呈可溶性表达,具有ATP酶生物学活性,在pH7、23℃和Mg2+存在的条件下,其活性最强,其他金属离子如Ca2+、Mn2+和Co2+都对其有不同程度的抑制作用。本研究为进一步研究猪链球菌噬菌体的包装机制奠定基础。

牦牛心脏原代成纤维细胞系的建立及鉴定

旨在建立牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系并对其进行鉴定.以牦牛胚胎心脏组织块为研究对象,运用组织块法对其进行分离培养获得原代细胞,使用胰酶消化法对原代细胞进行传代培养,通过MTT法检测细胞增殖活性,利用HE染色法及秋水仙素处理染色体鉴定细胞外形,选取4个成纤维标志性基因TGF-β、FSP-1、S100A4、Vimentin,通过RT-qPCR技术对基因的表达情况进行鉴定.结果显示成功将原代分离培养的成纤维细胞传代至11代;通过外型的一系列检测方法发现其符合成纤维细胞的外形,该细胞活力充足,生长规律符合“S”型生长曲线;荧光定量检测以上四种成纤维细胞特征性基因在不同代数中均表达且相对稳定,结果证实分离培养出的细胞符合成纤维细胞系的分子表达特征.本研究成功建立了牦牛胚胎心脏原代成纤维细胞系,集成了该细胞系的鉴定流程,为今后牦牛进一步研究提供相关的细胞系平台.

成都地区犬腺病毒2型分子流行病学调查及其纤突基因的生物信息学分析

为了解成都地区犬腺病毒2型(canine Adenovirus tgpe 2,CAV-2)的流行情况及其纤突基因的遗传变异情况,试验对采集的291份样本(鼻腔样本78份、粪便样本213份)进行PCR检测,利用SPSS软件分析CAV-2感染与犬年龄、性别、免疫情况及季节之间的关系;对CAV-2阳性样本的纤突基因进行全基因扩增,并利用生物信息学软件对其遗传变异情况进行研究。结果表明:在291份样本中,CAV-2阳性率为16.49%(48/291),其中鼻腔样本中CAV-2检出率为17.95%(14/78),粪便样本中CAV-2检出率为15.96%(34/213)。6月龄以下的幼龄犬中CAV-2检出率较高,与其他年龄犬只间存在显著差异(P<0.05);免疫完全犬的感染率与未免疫和不完全免疫幼犬间存在极显著差异(P<0.01));CAV-2的感染率无性别、季节等差异(P>0.05)。获得的48条CAV-2纤突基因序列与`GenBank中收录的国内外CAV-2毒株之间有较高的核苷酸序列同源性(98.3%~99.9%)和氨基酸序列同源性(98.5%~99.6%);48例阳性样本的核苷酸序列都处于同一CAV-2分支上,CAV-2的纤突蛋白氨基酸序列的糖基化位点都发生在N-Linked糖基化的N-X-T、N-X-S这两种保守序列段中,糖基化位点的数目和位置未发生改变。说明CAV-2纤突基因的遗传性稳定,在成都地区未显示明显变异。