多头绦虫膜蛋白(45M)对羊脑多头蚴病的免疫保护效果

目的观察多头绦虫膜蛋白(45M)对羊脑多头蚴病的免疫保护效果。方法12只新疆哈萨克羊随机均分为免疫组和对照组,免疫组用重组多头绦虫膜蛋白(45M)与佐剂乳化后颈部皮下2点免疫,抗原免疫剂量为50μg/只,注射体积为1ml,共免疫4次,每次间隔3周。对照组以谷胱甘肽硫转移酶(GST)表达物代替免疫抗原同法免疫。定时采集羊血,分离血清。ELISA法检测血清中IgG和IgM的抗体水平。于末次免疫后105d,免疫组和对照组每羊经口攻击感染5000个多头绦虫虫卵,感染2周后剖检羊脑多头蚴囊数,计算减囊率。将经孵化激活的六钩蚴分别置于含10%两组免疫攻击感染羊血清的RPMI1640培养液中培养,观察两组羊血清对多头绦虫六钩蚴的杀伤情况。结果免疫组有3只羊感染多头蚴包囊,平均囊荷数为1.5个,囊平均直径为2.2mm,免疫组减囊率为68.9%。六钩蚴与免疫组羊血清共培养72h后,90%死亡,被杀伤的六钩蚴出现萎缩,或膨胀致使内部结构模糊。ELISA检测结果显示,在第4次免疫后(第9周),免疫组IgG抗体水平达到最高(2.32±0.76),与对照组(0.70±0.42)间的差异有统计学意义(t=4.47,P<0.01)。经口感染六钩蚴后(第24周),免疫组IgG和IgM抗体水平(1.53±0.81,0.90±0.26)仍显著高于对照组(0.64±0.43,0.43±0.15)(P<0.01)。结论重组蛋白45M可引起机体较强的体液免疫反应。

EgM9免疫犬产生抗体变化规律的观察

目的用重组表达蛋白EgM9免疫实验犬,观察免疫犬的抗体变化及EgM9的免疫效果。方法用100μgEgM9及5mg的GST并辅以佐剂QuilA分别免疫实验犬,定期收集血清,以间接ELISA法检测血清中IgG及其亚类、IgM、IgA与IgE;感染45d后剖检实验犬,统计犬体内虫体数量。结果免疫组和对照组血清IgG与IgA差异显著(P<0.05);而IgG1与IgG2免疫组和对照组差异极显著(P<0.01);IgM与IgE免疫组和对照组无显著差异(P>0.05);相对于对照组,免疫组的保护率达86%。结论用重组蛋白EgM9免疫犬后能产生很高的抗体水平,可以抑制细粒棘球绦虫的发育,EgM9或许有望作为一种有效的候选疫苗成分用于包虫病的防治。

多头蚴病保护性基因的分离与表达

目的分离与表达多头绦虫（Taenia multiceps）基因45m，确定其免疫原性及在虫体不同发育阶段的表达。方法通过对绦虫同源基因序列分析设计引物，运用RT—PCR的方法，首次从绵羊多头绦虫的幼虫阶段分离到新的基因45m，将其克隆到pET41b表达载体中，获得了含正确读码框的重组质粒，将表达蛋白初步运用于动物免疫试验。结果45m基因长度为698bp，编码232个氨基酸。表达的重组蛋白分子量约为63kD，表达产量可达100～120mg／L。其蛋白序列与已知抗羊带绦虫（45W）和牛带绦虫保护性抗原的同源性分别为89％和85％。本动物绵羊的免疫接种试验表明该蛋白可有效激起机体的抗原抗体反应，其抗血清可以与多头绦虫的成虫和幼虫抗原总蛋白在63kD处发生特异性反应。结论45m蛋白可能具有较强抗原性，该蛋白在虫体的成虫和幼虫阶段均有表达，推测认为45m可能成为多头蚴病的候选疫苗。

绵羊脑多头蚴病45m基因在多头绦虫和细粒棘球绦虫不同发育阶段同源性的比较

目的研究绵羊多头蚴病45 M重组蛋白的同源性。方法将多头蚴的45 m基因片段亚克隆到pET41b表达质粒,构建45 m-pET41b原核表达系统,诱导表达45 M重组蛋白,制备小鼠高免血清,进行免疫印迹试验(Western blot);运用RT-PCR的方法,从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45 mA。结果45 M蛋白的高免血清可被细粒棘球绦虫不同发育阶段的天然抗原所识别,均在63kD处发生交叉反应;从多头绦虫的成虫cDNA中分离到45 m基因的同源基因,命名为45 mA(Gen-Bank号为EU326106),45 m和45 mA的核酸序列和蛋白序列分别有86%和76%的同源性;45 M和45 MA蛋白与细粒棘球蚴的保护性蛋白Eg95有57%的氨基酸同源性。结论提示45 m抗原分子在多头绦虫和细粒棘球绦虫的不同发育阶段均存在,为45 M蛋白的免疫原性的分析提供了宝贵的资料。

细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性分析

【目的】探索细粒棘球绦虫成虫表膜糖抗原的免疫性。【方法】细粒棘球绦虫成虫虫体冻融产物,经蛋白酶K消化,离心上清作为粗提表膜糖抗原,SDS-PAGE鉴定糖抗原成分,硫酸-蒽酮法测定多糖浓度,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测免疫小鼠抗血清抗体效价和特异性以及确定抗原在虫体组织中的位置。【结果】SDS-PAGE图谱显示无蛋白条带出现,表明成虫膜蛋白被蛋白酶K完全降解;制备的糖抗原浓度为2.54mg.mL-1,初步确定为糖抗原。ELISA结果显示,随着免疫次数增加,抗血清中特异性抗体(IgG、IgM和IgA)效价也随之升高。与阴性血清相比,IgG、IgM和IgA的P/N值分别为4.9、3.2和6.4。未检测到特异性IgE。Wenstern-blot检测结果显示,抗血清与原头蚴粗提虫体蛋白、细粒棘球绦虫成虫表膜蛋白、表膜糖抗原有效识别。IFA显色结果显示糖抗原在细粒棘球绦虫虫体表膜中有表达。【结论】经蛋白酶K消化后提取的细粒棘球绦虫表膜糖抗原具有良好的的免疫原性和免疫反应性,有望用于包虫病的诊断和免疫。

监测重组蛋白EgM9免疫犬的特异性抗体变化

【目的】探索EgM家族重组蛋白(EgM9)与Iscom为佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律。【方法】利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgGI、gG1I、gG2、IgA、IgM和IgE)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证。【结果】经统计学方法分析显示,免疫组与对照组特异性抗体IgG及其亚类IgG1I、gG2,差异极显著(P<0.01),而特异性抗体IgAI、gM和IgE差异不显著(P>0.05)。【结论】证实EgM家族重组蛋白(EgM9)与Iscom为佐剂结合能引起犬特异性免疫应答。

四种宠物鼠作为多房棘球绦虫的中间宿主的研究

用多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis,Em)原头蚴继发感染一线仓鼠(坎培尔仓鼠Dwarf Campbells RussianHamster)、冬白仓鼠(倭仓鼠Phodopus sungoris sungoris)、金丝熊仓鼠(黄金鼠Mesocricetus auratus)、松鼠(Sciurusvulgaris)4种宠物鼠各4只。接种70 d后剖解各种宠物鼠1只,一线仓鼠、金丝熊仓鼠、松鼠未发现包囊泡,冬白仓鼠分离出包囊泡4.37 g,占体重的7.23%;接种95 d后4种宠物鼠的平均湿包囊泡重和包囊泡重占体重的百分比分别为:冬白仓鼠13.05g和33.03%,金丝熊仓鼠2.22 g和1.98%,松鼠2.28 g和3.54%,冬白仓鼠、金丝熊仓鼠和松鼠都出现成熟原头蚴,一线仓鼠未发现包囊泡。试验证明冬白仓鼠、金丝熊仓鼠和松鼠对多房棘球绦虫原头蚴较敏感,可以作为Em的中间宿主。

EgM123免疫犬血清抗体监测

【目的】探索EgM家族重组蛋白(EgM 123)与弗氏佐剂结合免疫犬后血清抗体变化规律。【方法】利用间接ELISA法检测免疫组与对照组血清特异性抗体(IgG)的变化规律,并以Western-blotting方法进行验证。【结果】ELISA实验结果经统计学方法分析显示,不中和免疫组与对照组血清抗体时,特异性抗体IgG差异不显著(P>0.05),但中和血清抗体时,差异显著(P<0.05)。【结论】中和血清抗体,能够更明显的看到EgM家族重组蛋白(EgM 123)引起的犬特异性免疫应答。

用ELISA方法检测原头节及EgM免疫犬IgG变化情况

目的用不同的抗原检测免疫犬后的血清,判定所引起的IgG变化和有无与其他虫种的交叉反应。方法在用原头节可溶性粗抗原和EgM家族重组表达蛋白对犬的免疫保护实验中,以原头节可溶性粗抗原、细粒棘球绦虫成虫可溶性粗抗原和多头绦虫可溶性粗抗原包被检测时,通过间接ELISA的方法检测其中的特异性抗体IgG的变化规律及与多头绦虫抗原有无交叉反应。结果原头节可溶性粗抗原检测出相对应免疫组实验犬IgG应答变化情况,同时用细粒棘球绦虫成虫包被抗原亦检测出IgG存在一定差异,但不十分明显,与多头绦虫无交叉反应。检测EgM重组蛋白免疫组IgG时它们存在一定差异,但不十分明显。结论原头节可溶性粗抗原免疫组通过ELISA的方法较为准确地检测出其IgG的应答情况;EgM重组蛋白免疫组的抗体检测仍需进一步完善。

EgM9免疫犬引起细胞因子表达的变化规律研究

用重组表达蛋白EgM9免疫犬,通过实时定量PCR方法检测IFN-γ和IL-4表达的变化规律。用Trizol试剂提取新鲜全血的总RNA,取0.5μg总RNA,采用实时定量PCR法逆转录扩增IFN-γI、L-4和内参基因G3PDH,扩增产物经电泳分离后,用凝胶图像分析仪照相和扫描分析,检测其相对表达量。IFN-γI、L-4和G3PDH分别在202、3162、82 bp处出现明显条带,与GenBank查阅的基因条带大小基本一致;0、6、10、15周表达量依次升高,在15周时最高,IFN-γ尤为明显,它的变化始终大于IL-4。EgM9免疫犬后,能激起犬体内很强的细胞免疫和体液免疫反应,而且细胞免疫处主导地位。实时定量PCR方法为犬感染细粒棘球绦虫及其他疾病的早期诊断和流行病学调查提供了初步依据。

细粒棘球绦虫成虫表膜抗原特异性基因的筛选及克隆

为筛选细粒棘球绦虫（Echinococcus granulosus,Eg）表膜抗原基因或具有诊断性的特异性基因,提取Eg成虫表膜抗原,经ELISA、Western blot对该抗原的免疫学特性进行初步研究。以Eg成虫表膜抗原高免鼠血清为探针,筛选Eg成虫cDNA文库,将阳性噬菌斑的PCR产物和pGEM-T载体连接,转染到DH5α,对得到的重组子进行测序,并进行同源性分析。ELISA检测显示,表膜抗原免疫鼠诱导产生了特异性抗体,Western blot鉴定该抗体能识别Eg成虫表膜抗原、原头蚴、Eg发育不成熟、Eg发育成熟抗原。筛选出6个阳性克隆,DNA片段大小在1~2kb之间。对阳性克隆进行同源性分析,结果与EgP-29mRNA同源性为99%,与Eg14-3-3蛋白mRNA同源性80%-99%。筛选Eg成虫cDNA文库所获得的基因,证明了Eg虫体表膜抗原的存在,有望成为犬细粒棘球绦虫的诊断抗原以及犬抗细粒棘球绦虫的候选基因。

细粒棘球绦虫表膜糖抗原HSP70基因的克隆、表达及免疫特性分析

【目的】克隆细粒棘球绦虫(Eg)表膜糖抗原的热休克蛋白70(HSP70)基因,构建原核表达载体,鉴定EgHSP70蛋白的免疫学特性。【方法】以Eg表膜糖抗原高免鼠血清为探针,从Eg成虫cDNA文库中筛选得到阳性克隆EgHSP70。构建EgHSP70基因的原核表达载体pET28a-EgHSP70,诱导表达重组蛋白,纯化,免疫鼠,ELISA、Western-blot和IFA法分别检测血清抗体效价、特异性及抗原在虫体组织中的位置。【结果】从Eg成虫cDNA文库中筛选获得特异性EgHSP70基因,酶切和测序结果均表明该基因已克隆到pET28a。EgHSP70融合蛋白在A600=0.6,0.4 mmol IPTG,37℃表达5 h为最佳表达。经His亲和层析法纯化获得了HSP70融合蛋白相对分子质量约为33 kDa。免疫小鼠可产生高滴度(最高1:640 000)特异性抗体。Westernblot分析结果表明,制备的抗血清与EgHSP70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、Eg虫体蛋白和Eg虫体表面蛋白均能特异性结合,其他带科绦虫有此蛋白表达IFA检测结果证实EgHSP70在细粒棘球绦虫成虫体表膜及体表内有表达。【结论】实验得到的EgHSP7O融合蛋白具有较好的免疫原性和抗原性,可用于研制包虫病疫苗及相关诊断试剂为包虫病的防控提供技术支持。

犬抗细粒棘球绦虫疫苗候选蛋白EgM9的原核表达及纯化

把含有EgM9基因的质粒pET-41b转化至大肠杆菌BL-21中,IPTG诱导重组质粒的表达,亲和层析纯化表达产物,用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定,显示分离纯化的EgM9和GST蛋白纯度较高,1L的培养物约可以得到5mg纯化蛋白,分子量为60kDa。EgM9免疫后的血清与成熟虫体蛋白有特异性反应。融合蛋白获得高效表达,并成功纯化,初步实验证明EgM9具有良好的免疫原性,可进一步用于疫苗的免疫实验。

EgM9蛋白免疫犬肠系膜淋巴结中抗体的免疫荧光组织化学定位

以EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬及感染原头蚴犬3个组的肠系膜淋巴结为材料,用FITC标记羊抗犬IgG和羊抗兔IgG,分别采用一步法和三步法免疫荧光技术检测EgM蛋白免疫犬肠系膜淋巴结上的IgG和特异性IgG。结果显示,EgM蛋白免疫犬、EgM蛋白免疫后感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结组织有清楚可见的荧光点,而感染原头蚴犬的肠系膜淋巴结荧光较弱。两种方法均证明,EgM蛋白免疫犬后在其肠系膜淋巴结中可以产生特异性抗体。

新疆裕民县包虫病防治知识与相关行为调查

目的了解新疆裕民县居民对包虫病防治知识的知晓情况及相关行为和生活方式,为制定科学的防治计划提供依据。方法选取裕民县7个农/牧区(乡、镇)和一所学校,采取随机走访式问卷调查,了解当地居民对包虫病防治知识的知晓情况和防病行为并进行评价。结果 2009—2010年共调查848人,包虫病防治知识知晓率为42.81%,防病行为正确率为54.95%,不同职业的居民包虫病防治知识知晓率差异有统计学意义(χ2=24.689,P<0.01),不同族别(χ2=13.237)的居民防病行为正确率差异有统计学意义(P<0.01),防病行为正确率并不随知识知晓率的高低而改变;2011—2013年161团学校学生包虫病防治知识知晓率(χ2=58.539)和防病行为正确率(χ2=63.778)分别为51.67%和55.28%,差异有统计学意义(P<0.01),防病知识知晓率和防病行为正确率呈逐年上升趋势。结论当地居民知识知晓率和防病行为正确率均不高,但通过对学生逐年教育,效果明显;建议当地加强包虫病防治知识的健康教育工作,同时应当组建宣传培训队伍,加大经费投入,长期进行包虫病宣传教育工作。