二烯丙基二硫通过LIMK1-Cofilin1通路抑制人胃癌细胞侵袭与上皮-间质转化

目的:探讨二烯丙基二硫(DADS)对人胃癌MGC803细胞侵袭与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation,EMT)的影响及其机制。方法:体内外实验分为MGC803细胞组与DADS处理组。MTT、划痕实验与侵袭实验检测DADS对增殖、迁移与侵袭的影响。Western Blot检测LIMK1-Cofilin1通路与EMT相关蛋白表达。相差显微镜观察MGC803细胞形态改变。裸鼠实验检测DADS对移植瘤的作用。结果:MTT显示,DADS可呈时间依赖性抑制MGC803细胞增殖(P<0.05)。划痕实验显示,DADS组细胞迁移距离(59.9±1.9)μm较MGC803组(127.1±2.0)μm明显缩短(P<0.01)。侵袭实验显示,DADS组穿膜细胞(30.0±2.6)个较MGC803组(48.3±2.5)个明显减少(P<0.01)。Western Blot显示,DADS作用6 h、12 h、24 h、48 h后,MGC803细胞LIMK1、p-LIMK1与p-Cofilin1(P<0.001),Vimentin(P<0.001)与MMP-9(P<0.001)分别呈时间依赖性下调,而E-cadherin(P=0.001)与TIMP-3明显上调(P<0.001)。相差显微镜显示,DADS处理后,纤维母细胞样细胞减少,异型性显著降低。裸鼠实验显示,DADS组移植瘤较MGC803细胞组生长缓慢(P<0.05),DADS组移植瘤重量较MGC803细胞组降低,抑瘤率为60.19%(P<0.001),Ki-67、Vimentin、Snail和CD34阳性表达均降低,E-cadherin表达增加。结论:DADS可通过LIMK1-Cofilin1通路体内外抑制MGC803细胞侵袭与EMT。

DADS体内诱导人胃癌细胞分化作用中组蛋白乙酰化的变化

目的观察二烯丙基二硫(DADS)在体内诱导胃癌细胞分化的作用及对人胃癌细胞移植瘤组蛋白乙酰化的影响。方法裸鼠皮下注入人胃癌细胞MGC803建立人胃癌异种移植模型,采用光学显微镜观察移植瘤细胞形态变化,流式细胞光度术和W estern b lot分析DADS对MGC803细胞移植瘤细胞周期分布的影响及瘤组织中p21WAF1蛋白、组蛋白H3、H4乙酰化的表达情况。结果腹腔注射DADS剂量为100、200 mg.kg-1时对移植瘤有明显生长抑制作用;光学显微镜显示经DADS处理后瘤细胞密度及异型性明显减小。流式细胞仪分析结果显示DADS呈浓度依赖性将移植瘤细胞阻滞在G2/M期。DADS浓度为100 mg.kg-1和200 mg.kg-1作用瘤细胞后,与对照组相比分别可使G2/M期细胞增加2.22和3.37倍。W estern b lot分析表明在G2/M期阻滞同时有组蛋白H3乙酰化表达增加,但组蛋白H4乙酰化表达水平不受DADS作用的影响;瘤组织中的p21WAF1蛋白表达量也随DADS浓度升高而上升。结论DADS对胃癌细胞裸鼠移植瘤的生长有明显抑制和诱导分化作用,这种抑制可能与其阻滞移植瘤细胞周期、上调瘤细胞组蛋白乙酰化及p21WAF1蛋白水平有关。

二烯丙基二硫对人胃癌细胞裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用

背景与目的:既往研究发现二烯丙基二硫(diallyldisulfide,DADS)在体外可抑制多种肿瘤细胞生长,但在体内抗肿瘤作用的研究报道较少。本实验旨在探讨DADS对人胃癌细胞移植瘤在BALB/C裸鼠体内生长的影响。方法:未经药物处理和经30mg/LDADS处理1天的胃癌细胞MGC803接种于裸鼠皮下;观察体外DADS处理MGC803细胞裸鼠移植瘤的成瘤情况和未处理MGC803细胞移植瘤成瘤后腹腔注射DADS对胃癌移植瘤在BALB/c裸鼠体内生长情况的影响。Westernblot检测瘤组织中增殖细胞核抗原(proliferatingcellnuclearantigen,PCNA)的表达情况。结果:30mg/LDADS处理的MGC803细胞移植裸鼠体内无一成瘤。荷瘤裸鼠腹腔注射DADS剂量为50、100和200mg/kg时的抑瘤率分别为27.8%、66.1%和73.0%,同时可抑制移植瘤癌细胞PCNA的表达。结论:DADS可明显降低胃癌细胞裸鼠移植瘤的成瘤性,并对移植瘤生长有明显抑制作用。

二烯丙基二硫下调β-catenin抑制人胃癌MGC803细胞EMT

目的研究二烯丙基二硫(DADS)抑制人胃癌MGC803细胞EMT与形态学变化。方法应用相差显微镜与透射电镜观察30 mg·L-1DADS处理后的MGC803细胞形态学与超微结构的变化。RT-PCR与Western blot检测β-catenin和EMT标记E-cadherin与Vimentin表达。结果 30 mg·L-1DADS处理MGC803细胞24 h后,相差显微镜显示,与未处理比较,细胞圆形、椭圆形,核浆比值降低,巢状分布,均未见伪足。透射电镜显示,细胞表面微绒毛数目减少,细胞核变规整,核浆比值下降,异型性降低,细胞与细胞之间出现连接结构,细胞器增多。RT-PCR与Western blot表明,DADS可呈时间依赖性分别下调MGC803细胞β-catenin和Vimentin mRNA与蛋白和上调E-cadherin mRNA与蛋白。结论 DADS可通过下调β-catenin上调E-cadherin与下调Vimentin抑制EMT和伪足形成。

组蛋白乙酰化在二烯丙基二硫诱导MGC803细胞分化中的作用

探讨二烯丙基二硫(DADS)诱导人胃癌MGC803细胞分化过程中组蛋白乙酰化状态的改变情况。运用形态学方法及成瘤实验观察DADS诱导MGC803细胞分化,应用Western印迹观察DADS诱导MGC803细胞分化与其调控细胞组蛋白乙酰化水平和相关p21WAF1的关系。形态学观察结果显示,30mg/LDADS处理MGC803细胞24h后,细胞异型性明显减少,且经裸鼠成瘤实验证实,处理后的细胞均未在裸鼠体内形成肿瘤;Western印迹显示,30mg/LDADS处理细胞12h后,其组蛋白H3乙酰化程度明显升高,与未处理组比较增加了38%(P<0.05);H4乙酰化程度无明显改变。用15、30、60mg/LDADS处理细胞12、24h后,p21WAF1均较对照组升高,以30mg/LDADS处理24h升高最显著。研究结果表明,DADS可诱导MGC803细胞分化,其作用可能与增加核组蛋白乙酰化水平及p21WAF1表达有关。

烯丙基硫化物抗肿瘤进展

大蒜有效成分烯丙基硫化物的抗肿瘤作用被广大学者所关注。烯丙基硫化物在抗肿瘤方面的作用有抑制细胞生长,调控细胞周期依赖素激酶,参与肿瘤发生的信号转导,诱导肿瘤细胞分化和凋亡,减少癌基因、增加抑癌基因表达,调节生物酶活性等。

奥沙利铂联合表柔吡星和5-Fu治疗晚期胃癌疗效和安全性研究

目的:研究分析奥沙利铂与表柔吡星、5-Fu联合治疗晚期胃癌的临床效果。方法:选取2012年7月-2013年7月在笔者所在医院接受治疗的62例晚期胃癌患者,运用抽签法则将其分成研究组与对照组,每组31例。对照组患者应用顺铂与亚叶酸钙、5-Fu联合治疗,研究组患者应用奥沙利铂与表柔吡星、5-Fu联合治疗。对比观察两组患者的临床疗效、安全性。结果:研究组31例患者治疗的总缓解率为70.97%(22/31),远远大于对照组的45.16%(14/31),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。研究组患者恶心呕吐、贫血、血小板减少、中性粒细胞减少、外周神经感觉异常等不良反应发生率方面均明显低于对照组,两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:奥沙利铂与表柔吡星、5-Fu联合用于晚期胃癌的治疗效果更为突出,并且药物产生的毒副作用较轻,患者可以耐受,适合在临床治疗中进一步推广、应用。

二烯丙基三硫通过Caspase-3途径诱导人胃癌MGC803细胞凋亡

背景与目的:大蒜及其烯丙基硫化物具有抗肿瘤作用,但其具体的作用机制尚不十分清楚。本研究探讨二烯丙基三硫(diallyltrisulfide,DATS)诱导人胃癌MGC803细胞凋亡及凋亡过程中Caspase-3的变化及其意义。方法:采用荧光显微镜和电子显微镜观察以及流式细胞术和Westernblot检测等方法,观察DATS诱导MGC803细胞凋亡的作用及对活化的Caspase-3的影响。结果:在荧光显微镜及电子显微镜下,DATS作用的胃癌细胞出现了典型的凋亡形态学改变;流式细胞术检测出现明显的亚G1峰;12mg/L的DATS处理MGC803细胞0、4、8、12、24h后,活化的Caspase-3的表达率分别为1.9%、3.0%、7.3%、14.4%、27.6%,提示DATS呈时间依赖性促进活化的Caspase-3的表达;用特异的Caspase-3抑制剂预处理细胞后,再用12mg/LDATS处理细胞24h,与单用DATS组相比,凋亡率从23.0%降低到5.1%(P<0.01),提示Caspase-3的抑制剂能抑制DATS诱导的胃癌MGC803细胞凋亡。Westernblot显示酶原形式的Caspase-3被水解活化。结论:DATS诱导人胃癌MGC803细胞凋亡可能与活化Caspase-3有关。

二烯丙基三硫诱导人胃癌细胞凋亡与钙稳态失衡相关

目的探讨二烯丙基三硫(DATS)对人胃癌MGC803细胞的促凋亡作用及钙稳态失衡与该作用的相关性。方法体外培养MGC803细胞,采用MTT法,Tunnel法及流式细胞光度术分析经DATS处理后,对细胞增殖和凋亡的影响以及细胞内游离钙水平的改变。结果DATS处理后,培养的MGC803细胞增殖抑制。4、8、12、16、24mg·L-1的DATS对细胞生长的抑制率分别为0.231±0.037,0.305±0.036,0.455±0.029,0.607±0.058,0.751±0.019。Tunnel检测结果显示,对照组表达阴性,DATS处理组细胞呈阳性表达。流式细胞分析结果显示DATS呈浓度依赖性诱导胃癌MGC803细胞凋亡,16mg·L-1组凋亡率达0.242。细胞内游离钙水平呈浓度依赖性上升,16mg·L-1组荧光强度为对照组的4倍多。用细胞内游离钙特异性阻断剂BAPTAAM预处理细胞后,细胞内游离钙水平不再上升,且能抑制DATS诱导的凋亡。结论DATS能诱导胃癌MGC803细胞凋亡,DATS诱导胃癌MGC803细胞凋亡的作用与钙稳态失衡相关。

DADS对Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞G_2/M期的影响

目的在建立Chk1/2基因高表达人胃癌MGC803细胞基础上,探讨DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞G_2/M期的作用。方法分别采用集落形成实验、流式细胞术、RTPCR、Western blot等方法,检测DADS对Chk1/2高表达MGC803细胞增殖、细胞周期分布、Chk1与Chk2 mRNA与蛋白、p-Chk1与p-Chk2及CDC25C与cyclinB1的表达。结果软琼脂集落形成实验显示,30 mg·L^(-1)DADS作用Chk1与Chk2高表达MGC803细胞组集落形成率均明显低于对照组与空载体组(P<0.05)。流式细胞术显示,30 mg·L^(-1)DADS作用12、24、36、48 h后,Chk1/MGC803细胞G_2/M期分别为41.3%、57.4%、68.9%、42.9%,较MGC803细胞与Chk2/MGC803细胞明显增加(P<0.05)。而Chk2/MGC803细胞与MGC803细胞差异没有显著性(P>0.05)。RT-PCR显示,Chk1/MGC803与Chk2/MGC803细胞Chk1与Chk2mRNA水平较对照组无明显变化;并且,Western blot显示,Chk1与Chk2总蛋白及p-Chk2的表达无明显改变,但pChk1呈时间依赖性上调,CDC25C与cyclinB1呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论 DADS可阻滞Chk1/MGC803细胞于G_2/M期,与上调磷酸化Chk1和下调CDC25C与cyclinB1有关。

RORα高表达对人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响

目的观察RORα高表达对MGC803细胞增殖与迁移侵袭的影响。方法构建高表达RORα人胃癌MGC803细胞。Real-time PCR或RT-PCR和Western blot检测RORα、MMP-9与TIMP3 m RNA和蛋白表达。MTT、流式细胞术、迁移和侵袭实验检测RORα高表达对MGC803细胞增殖、细胞周期、迁移和侵袭能力的影响。结果 RORα高表达MGC803细胞RORαm RNA和蛋白表达显著上调。在48、72与96 h,RORα高表达细胞的增殖活性明显低于对照组和空载体组(P<0.05)。RORα高表达G_2/M期细胞明显高于对照组和空载体组(P<0.05)。高表达组细胞的迁移距离较对照组与空载体组明显减少(P<0.05)。高表达组穿膜细胞数较对照组与空载体组明显减少(P<0.05)。RORα高表达可明显下调MMP-9和上调TIMP3m RNA与蛋白。结论成功构建RORα高表达MGC803细胞,RORα高表达可抑制MGC803细胞增殖与迁移侵袭,将细胞阻滞于G_2/M期,其机制可能与下调MMP-9和上调TIMP3有关。

二烯丙基三硫诱导人胃癌细胞凋亡与活性氧之间的关系

目的:探讨二烯丙基三硫(diallytrisulfide,DATS)诱导人胃癌细胞系MGC-803凋亡与细胞内活性氧(re-activeoxygenspecies,ROS)之间的关系。方法:用12mg/L的DATS作用于体外培养的MGC-803细胞24h后,用流式细胞术检测凋亡率及细胞内活性氧水平。结果:12mg/LDATS作用于MGC-803细胞24h后,细胞凋亡率明显上升;细胞内活性氧水平与DATS呈浓度依赖性升高。用抗氧化剂NAC预处理细胞,能抑制细胞内活性氧水平的升高及DATS诱导的细胞凋亡。结论:DATS诱导胃癌细胞凋亡与细胞内活性氧产生增加有关。

二烯丙基二硫下调LIMK1抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞迁移侵袭及LIMK1表达的影响。方法MTT、划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对MGC803细胞增殖、迁移与侵袭能力的作用;RT-PCR、Western blot与免疫细胞化学检测LIMK1表达。结果 MTT显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞24、48、72、96 h后,增殖抑制率分别为31.8%、66.1%、83.6%、89.2%,呈明显的时间依赖关系(P<0.05)。划痕实验显示,10、20、30、40、50 mg.L-1DADS分别作用MGC803细胞,划痕愈合明显慢于对照组,呈剂量依赖关系(P<0.05)。侵袭实验显示,10、20、30、40、50 mg.L-1DADS作用MGC803细胞24 h后,穿过基质胶的细胞数分别为(35.8±3.74)、(34.1±2.02)、(31.7±4.81)、(17.2±3.08)、(13.2±3.36)个,较对照组(39.5±2.99)个数明显减少,呈剂量依赖性(P<0.05)。RT-PCR显示,30 mg.L-1DADS与MGC803细胞作用48 h后,LIMIK1mRNA明显下调(P<0.05)。Western blot与免疫细胞化学检测显示,30 mg.L-1DADS作用MGC803细胞6、12、24、48h后,LIMK1蛋白的表达水平呈时间依赖性下降(P<0.05)。结论 DADS可抑制人胃癌MGC803细胞迁移与侵袭能力,其机制可能与下调LIMK1有关。

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G2／M期检查点Chk1与Chk2的影响

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)对人胃癌MGC803细胞G2/M期检查点Chk1与Chk2的影响。方法流式细胞术检测细胞周期改变;Northern blot、Westernblot与免疫细胞化学检测DADS处理MGC803细胞的Chk1与Chk2表达。结果流式细胞术分析显示,30 mg.L-1DADS呈时间依赖性阻滞MGC803细胞在G2/M期(P<0.05);Northern blot检测表明,DADS不同时间作用MGC803细胞后,Chk1与Chk2 mRNA表达与未处理组差异无显著性(P>0.05);免疫细胞化学发现Chk1与Chk2表达与未处理组无明显改变(P>0.05);Western blot DADS在不同时间对MGC803细胞Chk1与Chk2总蛋白表达无改变(P>0.05),而磷酸化的Chk1表达呈时间依赖性增加(P<0.05),但磷酸化的Chk2无明显改变(P>0.05)。结论 DADS阻滞MGC803细胞G2/M期与磷酸化Chk1有关。

二烯丙基二硫上调RORα抑制人胃癌细胞Wnt/β-catenin通路靶基因

目的观察DADS上调RORα对人胃癌MGC803细胞Wnt/β-catenin通路相关分子与靶基因表达的影响。方法RT-PCR、Western blot与免疫共沉淀检测Wnt/β-catenin通路相关分子与靶基因表达。荧光素酶报告基因检测c-Myc基因启动子活性。结果 RT-PCR与Western blot显示,DADS处理后各组RORαmRNA与蛋白表达上调(P<0.05),而沉默RORα较对照组明显下调(P<0.05)。DADS处理后各组Wnt1 mRNA与蛋白表达下调(P<0.05)。沉默RORα较对照组Wnt1 mRNA与蛋白明显上调(P<0.05)。DADS处理前后各组β-catenin mRNA与蛋白表达差异无显著性(P>0.05)。免疫共沉淀显示,DADS处理组RORα与β-catenin结合明显增加,而沉默组与β-catenin结合明显减少(P<0.05)。DADS可明显下调核内β-catenin与p-β-catenin(P<0.05),而沉默RORα可明显上调β-catenin与p-β-catenin(P<0.05)。同时,DADS可明显下调TCF-4表达(P<0.05),而沉默RORα可明显上调TCF-4(P<0.05)。DADS可明显下调Axin、c-Myc、c-Jun mRNA与蛋白表达(P<0.05),而沉默RORα作用相反(P<0.05)。荧光素酶报告基因检测显示,DADS处理后,各组c-Myc启动子活性明显低于处理前(P<0.05)。沉默组c-Myc启动子活性明显高于对照组(P<0.05)。结论 DADS可上调RORα抑制Wnt/β-catenin通路相关分子与靶基因表达。

二烯丙基二硫诱导人胃癌MGC803细胞分化的差异蛋白质分析

目的研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人胃癌MGC803细胞分化过程中蛋白质的差异表达。方法用固相pH梯度双向凝胶电泳分离DADS处理前后人胃癌MGC803细胞总蛋白,凝胶经过银染后用PDQuest软件进行分析,差异蛋白质点经胶内原位酶解,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定肽质量指纹图(PMF),将所得的数据进行生物信息学处理。结果 DADS处理MGC803细胞前后的总蛋白质的双向电泳银染图谱,经扫描成像及PDQuest软件分析,对照组与处理组蛋白质点与平均匹配率分别为(576±14)个和(583±4)个与76%和70%,421个匹配,200个未被匹配。经相关数据库查询,在初步鉴定的差异蛋白质点中,发现24个与细胞分化、肿瘤转移、细胞凋亡、细胞周期、细胞免疫及代谢等相关的蛋白质,如gastric mucin、nM23、CDC2、uPAR、LIMK、RORα、MHC DR-beta-1 chain、TCR等,这些蛋白质可能在胃癌的发生发展中起着潜在的作用。结论 DADS可能通过多种途径诱导MGC803细胞分化。蛋白质组差异表达的初步分析为进一步研究胃癌分化的相关蛋白质及标记物奠定一定基础。

DADS通过Rac1-ADF/cofilin1通路抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭

目的:研究二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)通过Rac1-ADF/cofilin1通路对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的作用。方法:划痕愈合和侵袭实验分别检测DADS对SW480细胞迁移与侵袭的影响;RT-PCR与Western blot检测DADS对SW480细胞Rac1-ADF/cofilin1信号分子表达的作用。结果:40与50 mg/L DADS处理SW480细胞24 h后,穿膜细胞分别减少57.12%与64.59%(P<0.05)。处理48 h细胞迁移率分别为23.23%与12.87%,较对照组75.86%明显降低(P<0.05)。RT-PCR显示,45 mg/LDADS处理SW480细胞24、48 h后,与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin mRNA分别显著下调(P<0.01);而cofilin1mRNA无显著性差异(P>0.05)。Western blot显示,45 mg/L DADS处理SW480细胞6、12、24、48 h后,与对照组比较Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1和destrin蛋白分别呈时间依赖性下调(P<0.05),但cofilin1蛋白无显著性差异(P>0.05),而p-LIMK1和p-cofilin1表达分别呈时间依赖性下调(P<0.05)。结论:DADS可通过Rac1-ADF/cofilin1通路下调Rac1、Rock1、PAK1、LIMK1、p-LIMK1、destrin与p-cofilin1抑制SW480细胞迁移与侵袭。

DADS上调RORα抑制人胃癌MGC803细胞增殖与迁移侵袭

目的研究二烯丙基二硫(DADS)是否通过上调维甲酸相关孤核受体α(RORα)表达抑制人胃癌MGC803细胞增殖、细胞周期与迁移侵袭。方法实验组分为6组,对照组,空载体组,RORα干扰组(miRRORα),DADS组,空载体联合DADS组,miR-RORα联合DADS组。Western blot检测RORα、MMP-9与TIMP3蛋白表达。MTT、流式细胞术、迁移和侵袭实验分别检测细胞增殖、细胞周期与迁移侵袭的改变。结果 DADS处理细胞24 h后,与对照组和空载体组比较,DADS上调RORα和TIMP3、下调MMP-9蛋白表达。干扰组较对照组与空载体组RORα表达明显下调。与DADS处理组比较,干扰RORα表达上调MMP-9、下调TIMP3蛋白表达。MTT实验显示,DADS抑制MGC803细胞增殖,而干扰RORα表达促进增殖。流式细胞术显示,DADS诱导G2/M期阻滞,下调RORα削弱其作用。迁移实验显示,DADS处理组迁移距离明显减少。RORα干扰组迁移距离明显高于对照组和空载体组。侵袭实验显示,DADS处理组较对照组和空载体组穿膜细胞明显减少。干扰组穿膜细胞明显多于对照组和空载体组。干扰RORα表达降低DADS对细胞迁移和侵袭的抑制作用。结论 DADS上调TIMP3表达,下调MMP-9表达,抑制MGC803细胞增殖与迁移侵袭,其作用机制与上调RORα表达有关。

稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的c DNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORαc DNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pc DNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pc DNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的c DNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORαmRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pc DNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。

LIMK1在结肠癌中表达与沉默对人结肠癌细胞迁移与侵袭的影响

目的探讨LIMK1在结肠癌中的表达与临床病理参数的关系和沉默LIMK1对人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭的影响。方法免疫组化检测LIMK1在结肠癌表达;RNA干扰建立LIMK1-miR/SW480细胞株;RTPCR与Western blot分别检测LIMK1 mNRA与蛋白及磷酸化LIMK1表达;划痕实验和侵袭实验检测沉默LIMK1对SW480细胞迁移与侵袭的影响。结果免疫组化显示,LIMK1在结肠癌中表达明显高于结肠正常组织,高分化腺癌表达明显低于中分化与低分化腺癌,而低分化高于中分化腺癌;<5.0 cm的结肠癌表达明显低于≥5.0 cm;淋巴结转移显著高于无转移;Dukes分期A+B组表达明显低于C+D组(P<0.05)。RT-PCR与Western blot显示,LIMK1-miR/SW480细胞LIMK1 mNRA与蛋白表达明显下调,表明成功构建稳定沉默LIMK1基因的SW480细胞。免疫细胞化学证实,沉默组LIMK1表达较未转染组与空载体组明显降低。Western blot显示,沉默组LIMK1和磷酸化LIMK1较未转染组与空载体组明显下调(P<0.05)。划痕实验显示,沉默组癌细胞迁移率(22.53%)较对照组(76.50%)与空载体组(72.14%)明显降低(P<0.05)。侵袭实验发现,沉默组穿膜细胞(43.67±1.51个)较未处理组(143.33±1.52个)与空载体组(136.34±1.53个)明显减少(P<0.05)。结论 LIMK1表达与结肠癌发生、大小、淋巴结转移及Dukes分期有关。沉默LIMK1基因可抑制人结肠癌SW480细胞迁移与侵袭。